JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Изоляция частиц липопротеинов из куриного яичного желтка для изучения бактериального патогена жирной кислоты Инкорпорации в Мембрана фосфолипиды

Published: May 15, 2019
doi:
10.3791/59538
, ,
1Department of Microbiology and Molecular Genetics,Michigan State University, 2Department of Physiology,Michigan State University

Summary

Этот метод обеспечивает основу для изучения включения экзогенных жирных кислот из сложных источников хозяина в бактериальные мембраны, в частности золотистый стафилококк. Для этого описаны протоколы для обогащения частиц липопротеинов из куриного яичного желтка и последующего профилирования жирных кислот бактериальными фосфолипидами с использованием масс-спектрометрии.

Abstract

Золотистый стафилококк и другие грамположительные патогены включают жирные кислоты из окружающей среды в мембранные фосфолипиды. Во время инфекции, большинство экзогенных жирных кислот присутствуют в принимающих частиц липопротеинов. Сохраняется неопределенность в отношении резервуаров жирных кислот-хозяев и механизмов, с помощью которых бактерии извлекают жирные кислоты из частиц липопротеинов. В этой работе мы описываем протоколы для обогащения частиц липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) из куриного яичного желтка и определяем, служат ли ЛПНП резервуарами жирных кислот для S. aureus. Этот метод использует объективный липидомный анализ и куриные ЛПНП, эффективную и экономичную модель для исследования взаимодействий между ЛПЛ и бактериями. Анализ интеграции S. aureus экзогенных жирных кислот из ЛПНП проводится с использованием высокой разрешения/точной масс-спектрометрии и тандемной масс-спектрометрии, что позволяет охарактеризовать состав жирных кислот бактериальной мембраны и объективное выявление новых комбинаций жирных кислот, которые возникают в бактериальных мембранных липидах при воздействии ЛПНП. Эти передовые методы масс-спектрометрии предлагают беспрецедентную перспективу инкорпорации жирных кислот, раскрывая конкретные экзогенные жирные кислоты, включенные в фосфолипиды. Методы, изложенные здесь, адаптируются к изучению других бактериальных патогенов и альтернативных источников сложных жирных кислот.

Introduction

Метициллин-резистентный S. aureus (MRSA) является ведущей причиной инфекции, связанной с здравоохранением, и связанная с этим устойчивость к антибиотикам является значительной клинической проблемой1,2,3. Поэтому разработка новых терапевтических стратегий является приоритетной задачей. Перспективная стратегия лечения грамположительных патогенов ингибирует синтез жирных кислот, требование для производства мембранного фосфолипида, который, в S. aureus, включает в себя фосфатидилглицерол (ПГ), лисил-ПГ, и кардиолипин4. В бактериях, производство жирных кислот происходит через синтез жирных кислот II путь (FASII)5, который значительно отличается от эукариотического аналога, что делает FASII привлекательной мишенью для развития антибиотиков5,6 . Ингибиторы FASII в первую очередь нацелены наFabI, фермент, необходимый для удлинения углеродной цепи жирных кислот 7. Ингибитор FabI триклозан широко используется в потребительских и медицинских товаров8,9. Дополнительные ингибиторы FabI разрабатываются несколькими фармацевтическими компаниями для лечения инфекции S. aureus 10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Тем не менее, многие грамположительных патогенов, в том числе S. aureus, способны очистки экзогенных жирных кислот для синтеза фосфолипидов, в обход ингибирования FASII27,28,29. Таким образом, клинический потенциал ингибиторов FASII обсуждается из-за значительных пробелов в наших знаниях об источниках жирных кислот-хозяев и механизмах, с помощью которых патогенные микроорганизмы извлекают жирные кислоты из организма27,28. Для устранения этих пробелов мы разработали объективный метод липидомного анализа для мониторинга включения экзогенных жирных кислот из частиц липопротеинов в мембранные фосфолипиды S. aureus.

Во время сепсиса, частицы липопротеинов-хозяев представляют потенциальный источник принимающих жирных кислот в сосудистой, так как большинство принимающих жирных кислот связаны с частицами30. Липопротеины состоят из гидрофильной оболочки, состоящей из фосфолипидов и белков, которые заключают гидрофобное ядро триглицеридов и холестериновых эстеров31. Четыре основных класса липопротеинов – хиломикрон, липопротеин с очень низкой плотностью, липопротеины высокой плотности и липопротеины низкой плотности (ЛПНП) – производятся хозяином и функционируют как липидные транспортные средства, доставляя жирные кислоты и холестерин в и из клетки-хозяина через сосуды. LDLs в изобилии в эстерифицированных жирных кислот, включая триглицериды и холестерин эфиры31. Ранее мы показали, что высокоочищенные лПЛА человека являются жизнеспособным источником экзогенных жирных кислот для синтеза PG, обеспечивая тем самым механизм для ингибитора FASII шунтирования32. Очистка человека LDLs может быть технически сложной и трудоемкой в то время как коммерческие источники очищенных человека LDLs являются непомерно дорогими для использования на регулярной основе или для выполнения крупномасштабных бактериальных экранов. Для устранения этих ограничений, мы изменили процедуру для обогащения ЛПНП из куриного яичного желтка, богатый источник частиц липопротеинов33. Мы успешно использовали нецелевые, с высоким разрешением / точной масс-спектрометрии и тандемной масс-спектрометрии для мониторинга включения человека LDL полученных жирных кислот в мембране S. aureus32. В отличие от ранее окоторыхажинных методов, этот подход может количественно изомерить отдельные жирные кислоты для каждого из трех основных типов стафилококковых фосфолипидов. Олеиновая кислота (18:1) является ненасыщенным жирным кислотом, присутствующим во всех частицах липопротеинов- хоста, которые легко включаются в S. aureus phospholipids29,30,32. S. aureus не способен синтезировать олеиновой кислоты29; Таким образом, количество фосфолипид-включенной олеиновой кислоты устанавливает наличие принимающих липопротеинов жирных кислот в стафилококковой мембране29. Эти фосфолипидные виды могут быть идентифицированы по описанному здесь методу масс-спектрометрии, предлагая беспрецедентное разрешение мембранного состава S. aureus, культивируется в присутствии источника жирных кислот, который, скорее всего, может быть встречается во время инфекции.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол для обогащения частиц ЛПНП из куриного яичного желтка получен из Moussa et al. 200233. 1. Приготовление куриного яичного желтка для обогащения частиц ЛПНП Обезвить два больших куриных яйца, промыв скорлупу с 70% раствор атанола и да?…

Representative Results

Протокол для обогащения ЛПНП из куриного яичного желтка иллюстрируется на рисунке 1. Этот процесс начинается с разбавления всего яичного желтка солевом раствором и разделения твердых веществ яичного желтка, называемых гранулами из растворимых или пл?…

Discussion

S. aureus включает экзогенные жирные кислоты в мембрану фосфолипидов27,32,43. Синтез фосфолипидов с использованием экзогенных жирных кислот обходит ингибирование FASII, но также изменяет биофизические свойства мембраны27,</…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим сотрудников лаборатории Hammer за их критическую оценку рукописи и поддержку этой работы. Д-р Алекс Horswill из Университета Колорадо школы медицины любезно при условии AH1263. Доктор Крис Уотерс (Chris Waters Laboratory) из Мичиганского государственного университета предоставил реагенты. Эта работа была поддержана Американской ассоциацией сердца грант 16SDG30170026 и стартовых средств, предоставляемых Мичиганского государственного университета.

Materials

Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6×250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
  3. Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
  4. Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
  5. Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
  6. Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
  8. Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
  9. Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
  10. Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
  11. Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
  12. Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
  13. Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
  14. Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
  15. Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
  16. Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
  17. Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
  18. Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
  19. Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
  20. Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
  21. Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
  22. Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
  23. Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
  24. Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
  25. Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
  26. Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
  27. Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
  28. Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
  29. Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
  30. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
  31. Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
  32. Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
  33. Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
  34. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
  35. Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
  36. Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
  37. Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
  38. Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
  39. Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
  40. Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
  41. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
  42. Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
  43. Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
  44. Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
  45. Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
  46. Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
  47. Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
  48. Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts – Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
  49. Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
  50. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).

Tags

Lipoprotein ParticlesChicken Egg YolkBacterial PathogenFatty Acid IncorporationMembrane PhospholipidsLipidomic AnalysisStaphylococcus AureusAmmonium SulfateDialysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image