Summary

Aislamiento y la transferencia adoptiva de sal alta tratan células dendríticas presentadoras de antígenos

Published: March 05, 2019
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para aislar las células dendríticas de bazos murinos por clasificación magnética celular y posterior transferencia adoptiva en ratones ingenuos. El modelo de células dendríticas activadas de sal fue elegido para explicar los procedimientos paso a paso de transferencia adoptiva y citometría de flujo.

Abstract

La ingesta de sal excesiva contribuye a la inflamación y desempeña un papel vital en el desarrollo de la hipertensión arterial. Hemos encontrado que presentadoras de antígeno células dendríticas (DCs) pueden detectar sodio extracelular elevado conduce a la activación de la NADPH oxidasa y la formación de isolevuglandin (IsoLG)-aductos de proteínas. Estas proteínas IsoLG aductos reaccionan con proteínas de uno mismo y promover un estado autoinmune y la hipertensión. Hemos desarrollado y optimizado métodos de vanguardia para estudiar la función de DC en la hipertensión arterial. Presentamos un protocolo detallado para el aislamiento, en vitro tratamiento con sodio elevado y transferencia adoptiva de CD11c esplénicos murinos+ células en ratones receptores para estudiar su papel en la hipertensión arterial.

Introduction

Exceso de sal dietético es un factor de riesgo para la hipertensión. 1 , 2 la Asociación Americana del corazón recomienda un máximo de 2.300 miligramos (mg) de ingesta de sodio (Na+) por día, sin embargo; menos del 10% de la población de Estados Unidos observa esta recomendación. 3 , 4 reducciones moderadas en la ingesta de Na+ bajan la presión arterial y reducen los nuevos casos anuales de enfermedad coronaria y accidente cerebrovascular en los Estados Unidos en un 20%. 5 un gran problema con el consumo excesivo de sal es que 50% de la población hipertensa presenta sensibilidad a la sal, definida como un aumento de 10 mmHg en la presión arterial tras NaNa+ carga o una caída similar en la presión arterial + la diuresis y restricción. 6 sensibilidad a la sal también se produce en el 25% de los individuos normotensos y es un predictor independiente de muerte y eventos cardiovasculares. 7 , 8 mecanismos de detección de sal en la hipertensión con el riñón han sido bien estudiados; sin embargo, estudios recientes sugieren que las células inmunes pueden sentir Na+. 9 , 10

La evidencia reciente sugiere que cambios en extra renal Na+ manipulación pueden causar acumulación de Na+ en el intersticio y promover la inflamación. 11 , 12 nuestro laboratorio y otros han demostrado que las células del sistema inmunitario tanto innato y adaptativo contribuyen a la exacerbación de la hipertensión arterial. 9 , 13 , 14 , 15 varios estímulos de hipertensos, como la angiotensina II, norepinefrina y causa sal macrófagos, monocitos y linfocitos T que infiltran el riñón y vasculatura y promover la retención de Na+ , vasoconstricción, hipertensión elevación y daño de órganos. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 en estudios anteriores, encontramos que los DCs acumulan isolevuglandin (IsoLG)-proteína aductos en respuesta a diversos estímulos de hipertensos incluyendo angiotensina II e DOCA sal hipertensión. 14 IsoLGs son altamente reactivos productos de peroxidación lipídica que rápidamente y covalente aducción a lisinas en proteínas y su acumulación se asocia con la activación de la DC. 14 recientemente hemos establecido que elevado Na+ es un estímulo potente para la proteína IsoLG aducción formación murine DCs.9 Na+ entrar DCs es mediada por transportadores sensible amilorida. Na+ entonces se intercambia para el calcio (Ca2 +) vía el /Ca2 + intercambiador de Na+. CA2 + activa la proteína quinasa C (PKC) que activa la NADPH oxidasa lleva a mayor superóxido (O2· –) y proteína IsoLG aducción formación. 9 transferencia adoptiva de hipertensión de primos de DCs sal expuestos en respuesta a una dosis sub-presor de la angiotensina II. 9

Identificación de CD11c+ DCs de tejidos ha sido previamente limitada a la inmunohistoquímica y RT-PCR y aislamiento de DCs se ha limitado a ordenar por citometría de flujo de la célula. Aunque flujo citometría celular clasificación es un método eficaz para el aislamiento de las células inmunes, es costoso, desperdiciador de tiempo y conduce a una baja producción de células viables. Por lo tanto, nos hemos optimizado un protocolo paso a paso para la digestión de tejido, estimulación in vitro y transferencia adoptiva de CD11c+ DCs para el estudio de la hipertensión.

Protocol

De la Universidad de Vanderbilt institucional Animal Care y uso Comité han aprobado los procedimientos descritos en este documento. Ratones se ocupa y cuidadas según la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (prensa de Academias nacionales. Revisado 2010). 1. aislamiento de bazos de ratones Preparar el RPMI 1640: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, piruvato de sodio 1 m m, 50 μm β-mercaptoetanol y 1% de penicilina/estreptomicina. Eutanasia a 10 – 12 semanas-viejos…

Representative Results

La figura 1 representa un esquema de los pasos descritos arriba. Bazos de ratón aislados se ordenan para CD11c+ DCs por célula magnética clasificación y plateado en los medios de sal normales (NS; 150 mmol de NaCl) o alta media sal (capítulo; 190 mmol NaCl) para 48 h. CD11c+ DCs se transfieren eventualmente por retro-orbital inyección a los ratones receptores ingenuos. Diez días más tarde, se implantan ratones con osmótico minip…

Discussion

En el protocolo actual, hemos optimizado los procedimientos para aislar CD11c+ DCs de bazos de ratones y eventualmente transferirlos en ingenuos animales para estudiar el papel de la DCs en la hipertensión inducida por la sal. Este protocolo puede ser adaptada para aislar y eventualmente transferir otros subconjuntos de células inmunes como macrófagos, monocitos y células inmunitarias adaptativas incluyendo los linfocitos T y B. Hemos optimizado el proceso de digestión esplénico para lograr la superviven…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por American Heart Association otorga POST290900 N.R.B., 17SDG33670829 L.X. y institutos nacionales de salud otorgar K01HL130497 a A.K.

Materials

APC/Cy7 anti-mouse CD11c Biolegend 117324
autoMACS Running Buffer  Miltenyi Biotec 130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure  Miltenyi Biotec 130-108-338
Collagenase D Roche 11088866001
DNase I Roche 10104159001
DPBS without calcium and magnesium Corning 21-031-CV
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec  130-092-575
FITC anti-mouse CD45 Biolegend 103108
GentleMACS C tube Miltenyi Biotec 130-096-334
GentleMACS dissociator device Miltenyi Biotec 130-093-235 Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit Invitrogen L34964
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACs Seperator  Miltenyi Biotec 130-090-976
RPMI 1640 medium  Gibco 11835-030

Referências

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Citar este artigo
Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (145), e59124, doi:10.3791/59124 (2019).

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