Inducción de lesión pulmonar de ratón por inyección endotraqueal de bleomicina
Summary
Aquí presentamos un método eficaz para investigar la actividad antifibrotica de las células mesenquimales humanas infundidas por vía intravenosa obtenidas de todo el cordón umbilical tras la inducción de la lesión pulmonar mediante una inyección endotraqueal de bleomicina en C57BL /6 ratones. Este protocolo se puede extender fácilmente a las pruebas preclínicas de otras terapias.
Abstract
La fibrosis pulmonar es un sello distintivo de varias enfermedades pulmonares humanas con una etiología diferente. Dado que las terapias actuales son bastante limitadas, los modelos de ratón siguen siendo una herramienta esencial para desarrollar nuevas estrategias antifibroticas. Aquí proporcionamos un método eficaz para investigar la actividad antifibromática in vivo de las células estromales mesenquimales humanas obtenidas del cordón umbilical entero (hUC-MSC) en la atenuación de la lesión pulmonar inducida por bleomicina. Los ratones C57BL/6 reciben una única inyección endotraqueal de bleomicina (1,5 U/kg de peso corporal) seguida de una doble perfusión de hUC-MSC (2,5 x 105) en la vena de la cola, 24 h y 7 días después de la administración de bleomicina. Tras el sacrificio en los días 8, 14 o 21, se analizan los cambios inflamatorios y fibrosos, el contenido de colágeno y la presencia de hUC-MSC en el tejido pulmonar explantado. La inyección de bleomicina en la tráquea del ratón permite la orientación directa de los pulmones, lo que conduce a una inflamación pulmonar extensa y fibrosis. La administración sistémica de una dosis doble de hUC-MSC da como resultado la contundencia temprana de la lesión pulmonar inducida por bleomicina. Los hUC-MSC infundidos por vía intravenosa se injertan transitoriamente en los pulmones del ratón, donde ejercen su actividad antiinflamatoria y antifibrotica. En conclusión, este protocolo se ha aplicado con éxito para las pruebas preclínicas de hUC-MSC en un modelo experimental de ratón de fibrosis pulmonar humana. Sin embargo, esta técnica se puede extender fácilmente tanto para estudiar el efecto de diferentes sustancias administradas endotraquealmente en la fisiopatología de los pulmones como para validar nuevas terapias sistémicas antiinflamatorias y antifibromáticas.
Introduction
La fibrosis pulmonar es un proceso patológico progresivo caracterizado por la deposición excesiva de componentes de la matriz extracelular, principalmente colágeno de tipo I, en el intersticio pulmonar, lo que conduce a una función pulmonar deteriorada. Es el sello distintivo de varias enfermedades pulmonares humanas con una etiología diferente y representa un mal factor de pronóstico clínico. Dado que las terapias actuales son bastante limitadas1, los modelos de ratón siguen siendo una herramienta esencial tanto para la investigación ulterior de los mecanismos patógenos que influyen en la aparición y la progresión de la enfermedad como para el desarrollo de nuevos antifibrosticos estrategias2,3.
Hasta la fecha, la administración de bleomicina ha sido el modelo más comúnmente aplicado de fibrosis pulmonar inducida experimentalmente4. Además de múltiples métodos de administración (incluidos los métodos de administración intravenosos, intraperitoneales, subcutáneos e inhalatológicos), las inyecciones intratraales o endotraqueales de bleomicina han surgido como las rutas más utilizadas4,5. El método que describimos aquí se ha desarrollado para evitar el efecto escaldándose de la bleomicina en la mucosa traqueal. De hecho, al exteriorizar la tráquea y visualizarla a través de un microscopio operativo, es posible lograr la instilación de todo el volumen de solución de bleomicina directamente en las vías respiratorias inferiores sin derrames en las vías respiratorias superiores. Cuando se dispone de la experiencia quirúrgica y la instrumentación requeridas, este método permite la inducción segura, robusta y reproducible de la inflamación pulmonar y la fibrosis, como se indica a continuación.
Protocol
Representative Results
Discussion
La administración endotraqueal es la vía preferencial para la entrega de agentes exógenos en los pulmones. Desde hace varios años, la inyección directa de bleomicina en la tráquea se ha utilizado ampliamente para inducir la fibrosis pulmonar13 y, recientemente, se han desarrollado técnicas no invasivas más avanzadas para lograr este14,15 ,16.
El método descrito aquí …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención RF-2011-02352331 del Ministero Italiano della Salute (a Armando Gabrielli).
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
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