אינדוקציה של פגיעה בריאות העכבר על ידי הזרקת אנדוקנה של ליאומיצין
Summary
כאן אנו מציגים שיטה יעילה כדי לחקור את הפעילות האנטיפיברוטית של תאים בעלי מזון מסטרומה האנושית מתוך הגוף הפנימי שהתקבלו מן החבל הטבור כולו בעקבות אינדוקציה של פגיעה בריאה על ידי הזרקה אנדוקנה של ליאומיצין ב C57BL /6 עכברים. פרוטוקול זה ניתן להרחיב בקלות לבדיקה טרום קלינית של therapeutics אחרים.
Abstract
פיברוזיס ריאתי הוא סימן ההיכר של מספר מחלות ריאות האדם עם אטיולוגיה שונים. מאז הטיפולים הנוכחיים הם מוגבלים למדי, מודלים העכבר להמשיך להיות כלי חיוני לפיתוח אסטרטגיות אנטיפיברוטית חדשה. כאן אנו מספקים שיטה יעילה כדי לחקור בפעילות vivo antifibrotic של התאים האדם סטרומה mesenchymal שהתקבלו מחוט הטבור השלם (huc-MSC) בתוך החליש ליאומיצין פציעה ריאה. C57BL/6 עכברים לקבל הזרקה אנדוקנה הנשימה יחיד של ליאומיצין (1.5 U/ק”ג משקל הגוף) ואחריו עירוי כפול של hUC-MSC (2.5 x 105) לתוך הווריד האחורי, 24 h ו -7 ימים לאחר הממשל ליאומיצין. עם ההקרבה בימים 8, 14, או 21, שינויים דלקתיים ופיברוטית, תוכן קולגן, נוכחות hUC-MSC הסבר רקמת הריאה מנתחים. ההזרקה של ליאומיצין לתוך קנה הנשימה של העכבר מאפשר המיקוד הישיר של הריאות, המוביל לדלקת ריאות נרחבת פיברוזיס. הניהול הסיסטמתי של מנה כפולה של hUC-MSC תוצאות בתחילת blunting של פציעת הריאה ליאומיצין המושרה. באופן פנימי מוחדרת הווג-MSC לתוך הריאות העכבר, שם הן מפעילות את פעילותם האנטי-דלקתית והאנטיפיברוטית. לסיכום, פרוטוקול זה הוחל בהצלחה עבור בדיקות טרום קליני של hUC-MSC במודל עכבר ניסיוני של פיברוזיס ריאתי האדם. עם זאת, טכניקה זו יכולה להיות מורחבת בקלות הן כדי ללמוד את ההשפעה של חומרים שונים בעלי הקנה מנוהל באופן שונה על הפתופסולוגיה של הריאות וכלה לאמת טיפולים מערכתית אנטי דלקתיות ואנטיפיברוטית חדשה.
Introduction
פיברוזיס ריאתי הוא תהליך פתולוגי מתקדם המאופיין על ידי הפקדת מוגזמת של רכיבי מטריקס המתכלים, בעיקר סוג אני קולגן, בריאות interstitium, המוביל לתפקוד ריאות לקויי. זהו סימן ההיכר של מחלות ריאה אנושית עם אטיולוגיה שונה ומייצגת גורם התחזיות הקליני המסכן. מאז הטיפולים הנוכחיים הם מוגבלים למדי1, מודלים העכבר להמשיך להיות כלי חיוני הן עבור חקירה נוספת של מנגנוני פתוגניים המשפיעים על התחלתה ואת ההתקדמות של המחלה לפיתוח אנטיפיברוטיקה חדשה אסטרטגיות2,3.
עד כה, המינהל של ליאומיצין היה המודל הנפוץ ביותר של פיברוזיס הריאות המושרה בניסויים4. לצד מספר שיטות מרובות (כולל לעירוי, תוך הצפק, תת עורית ושאיפה), הליאומיצין באופן תדיר או בזריקות האנדוקנה, הופיעו כמסלולים הנפוצים ביותר4,5. השיטה שאנו מתארים להלן פותחה כדי למנוע את ההשפעה הרותח של ליאומיצין על רירית הקנה. למעשה, על ידי העברת הקנה ומדמיין אותו באמצעות מיקרוסקופ הפעלה, ניתן להשיג את החוסר של הנפח כולו של הפתרון ליאומיצין ישירות לתוך נתיב האוויר התחתון ללא כל נשפך בנתיב האוויר העליון. כאשר המומחיות והמכשור הכירורגי הנדרשים זמינים, שיטה זו מאפשרת בטיחות, חזקה, השראה האינדוקציה של דלקת ריאות פיברוזיס, כפי שדווח להלן.
Protocol
Representative Results
Discussion
הממשלה הקיימת מהווה מסלול מועדף לאספקת סוכנים אקגניים לריאות. מאז מספר שנים, הזרקה ישירה של ליאומיצין לתוך קנה הנשימה כבר בשימוש נרחב כדי לגרום פיברוזיס הריאות13 ו, לאחרונה, יותר מתקדם, טכניקות לא פולשני פותחו כדי להשיג את זה14,15 ,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענק RF-2011-02352331 מ Ministero איטלקית דלה הצדעה (כדי ארמנדו גבריאלי).
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
Referências
- Iudici, M., et al. Where are we going in the management of interstitial lung disease in patients with systemic sclerosis?. Autoimmunity Reviews. 14 (7), 575-578 (2015).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (2), L152-L160 (2008).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 17 (5), 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis?. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 40 (3), 362-382 (2008).
- Moore, B. B., et al. Animal models of fibrotic lung disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 167-179 (2013).
- Schrier, D. J., Kunkel, R. G., Phan, S. H. The role of strain variation in murine bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Review of Respiratory Disease. 127 (1), 63-66 (1983).
- Phan, S. H., Kunkel, S. L. Lung cytokine production in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 18 (1), 29-43 (1992).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Beeravolu, N., et al. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).
- Moroncini, G., et al. Mesenchymal stromal cells from human umbilical cord prevent the development of lung fibrosis in immunocompetent mice. PLoS One. 13 (6), e0196048 (2018).
- Shahzeidi, S., Jeffery, P. K., Laurent, G. J., McAnulty, R. J. Increased type I procollagen mRNA transcripts in the lungs of mice during the development of bleomycin-induced fibrosis. European Respiratory Journal. 7 (11), 1938-1943 (1994).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF?. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (4), L439-L441 (2010).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), e50269 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sciences. 152, 244-248 (2016).
- Sueblinvong, V., et al. Predisposition for disrepair in the aged lung. American Journal of Medical Sciences. 344 (1), 41-51 (2012).
- Moodley, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells reduce fibrosis of bleomycin-induced lung injury. American Journal of Pathology. 175 (1), 303-313 (2009).
- How, C. K., et al. Induced pluripotent stem cells mediate the release of interferon gamma-induced protein 10 and alleviate bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis. Shock. 39 (3), 261-270 (2013).
- Lee, R. H., et al. TSG-6 as a biomarker to predict efficacy of human mesenchymal stem/progenitor cells (hMSCs) in modulating sterile inflammation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), 16766-16771 (2014).
