تحريض إصابة الرئة الماوس عن طريق حقن الرغامى من بليموسين
Summary
هنا نقدم طريقة فعالة للتحقيق في النشاط المضاد للفيليمنت من الخلايا السترومال mesenchymal الإنسان غرست عن طريق الوريد التي تم الحصول عليها من الحبل السري كله بعد تحريض إصابة الرئة عن طريق حقن البلوميسين داخل الرغامى في C57BL ستة فئران هذا البروتوكول يمكن أن تمتد بسهولة إلى الاختبار قبل السريرية من العلاجات الأخرى.
Abstract
التليف الرئوي هو السمة المميزة للعديد من أمراض الرئة البشرية مع مسببات مختلفة. وبما أن العلاجات الحالية محدودة إلى حد ما، فإن نماذج الماوس لا تزال أداة أساسية لوضع استراتيجيات جديدة مضادة للفيليتيك. هنا نقدم طريقة فعالة للتحقيق في النشاط المضاد للفيليفي في الجسم الحي من الخلايا السترومال ية mesenchymal الإنسان التي تم الحصول عليها من الحبل السري كله (hUC-MSC) في تخفيف إصابة الرئة الناجمة عن البلوميسين. تتلقى الفئران C57BL/6 حقنة واحدة داخل الرغامى من البلميسين (1.5 U/kg من وزن الجسم)تليها ضخ مزدوج من hUC-MSC (2.5 × 10 5) في الوريد الذيل، 24 ساعة و 7 أيام بعد إدارة البليومسين. عند التضحية في الأيام 8، 14، أو 21، يتم تحليل التغيرات الالتهابية والليفية، ومحتوى الكولاجين، ووجود hUC-MSC في أنسجة الرئة المنفعلة. حقن bleomycin في القصبة الهوائية الماوس يسمح الاستهداف المباشر للرئتين، مما يؤدي إلى التهاب رئوي واسع والتليف. الإدارة النظامية لجرعة مزدوجة من hUC-MSC يؤدي إلى التعمية في وقت مبكر من إصابة الرئة الناجمة عن البلميسين. يتم تطعيم hUC-MSC عن طريق الوريد بشكل عابر في رئتي الماوس، حيث يمارسون نشاطهم المضاد للالتهابات ومضاد للفيليفي. وفي الختام، تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح للاختبار قبل السريري ة hUC-MSC في نموذج الماوس التجريبي للتليف الرئوي البشري. ومع ذلك، يمكن توسيع هذه التقنية بسهولة على حد سواء لدراسة تأثير المواد المختلفة التي تدار داخل التراخالية على الفيزيولوجيا المرضية للرئتين والتحقق من صحة العلاجات النظامية الجديدة المضادة للالتهابات والمضادة للفيلي.
Introduction
التليف الرئوي هو عملية مرضية تقدمية تتميز بالترس المفرط لمكونات المصفوفة خارج الخلية، أساسا النوع الأول الكولاجين، في الانترستيوم الرئة، مما يؤدي إلى ضعف وظيفة الرئة. وهو السمة المميزة للعديد من أمراض الرئة البشرية مع مسببات مختلفة ويمثل عامل التكهن السريري ة الفقراء. وبما أن العلاجات الحالية محدودة إلى حد ما1، لا تزال نماذج الماوس أداة أساسية على حد سواء لمواصلة التحقيق في الآليات المسببة للأمراض التي تؤثر على بداية وتطور المرض ولتطوير مضادات الفيلية الجديدة استراتيجيات2،3.
حتى الآن، كانت إدارة bleomycin النموذج الأكثر شيوعا من التليف الرئوي المستحث تجريبيا4. بجانب طرق التسليم المتعددة (بما في ذلك الحقن الوريدي، داخل البريكيوني، تحت الجلد، والاستنشاق)، ظهرت الحقن داخل الرغامى أوداخل الرغامى من البلميسين كأكثر الطرق استخداما4و5. وقد وضعت الطريقة التي نصفها هنا لتجنب تأثير التحجيم من البلويمايسين على الغشاء المخاطي للرغامى. في الواقع، من خلال تجهر القصبة الهوائية وتصورها من خلال مجهر التشغيل، فمن الممكن تحقيق غرس كامل حجم محلول البلميسين مباشرة في مجرى الهواء السفلي دون أي انسكابات في مجرى الهواء العلوي. عندما تتوفر الخبرة الجراحية المطلوبة والأجهزة، تسمح هذه الطريقة للتحريض الآمن والقوي والقابل للاستنساخ لالتهاب الرئة والتليف، كما هو مبين أدناه.
Protocol
Representative Results
Discussion
إدارة الرغامى هو الطريق التفضيلي لإيصال العوامل الخارجية في الرئتين. منذ عدة سنوات ، تم استخدام الحقن المباشر للبلميسين في القصبة الهوائية على نطاق واسع للحث على التليف الرئوي13 ، ومؤخرا ، تم تطوير تقنيات أكثر تقدما ، غير الغازية لتحقيق هذا14،15 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل بمنحة RF-2011-02352331 من Ministero Italiano della Salute (إلى أرماندو غابرييلي).
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
Referências
- Iudici, M., et al. Where are we going in the management of interstitial lung disease in patients with systemic sclerosis?. Autoimmunity Reviews. 14 (7), 575-578 (2015).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (2), L152-L160 (2008).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 17 (5), 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis?. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 40 (3), 362-382 (2008).
- Moore, B. B., et al. Animal models of fibrotic lung disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 167-179 (2013).
- Schrier, D. J., Kunkel, R. G., Phan, S. H. The role of strain variation in murine bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Review of Respiratory Disease. 127 (1), 63-66 (1983).
- Phan, S. H., Kunkel, S. L. Lung cytokine production in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 18 (1), 29-43 (1992).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Beeravolu, N., et al. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).
- Moroncini, G., et al. Mesenchymal stromal cells from human umbilical cord prevent the development of lung fibrosis in immunocompetent mice. PLoS One. 13 (6), e0196048 (2018).
- Shahzeidi, S., Jeffery, P. K., Laurent, G. J., McAnulty, R. J. Increased type I procollagen mRNA transcripts in the lungs of mice during the development of bleomycin-induced fibrosis. European Respiratory Journal. 7 (11), 1938-1943 (1994).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF?. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (4), L439-L441 (2010).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), e50269 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sciences. 152, 244-248 (2016).
- Sueblinvong, V., et al. Predisposition for disrepair in the aged lung. American Journal of Medical Sciences. 344 (1), 41-51 (2012).
- Moodley, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells reduce fibrosis of bleomycin-induced lung injury. American Journal of Pathology. 175 (1), 303-313 (2009).
- How, C. K., et al. Induced pluripotent stem cells mediate the release of interferon gamma-induced protein 10 and alleviate bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis. Shock. 39 (3), 261-270 (2013).
- Lee, R. H., et al. TSG-6 as a biomarker to predict efficacy of human mesenchymal stem/progenitor cells (hMSCs) in modulating sterile inflammation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), 16766-16771 (2014).
