Люминесцентные серебряные пятная белков в полиакриламидных гелей

Многие пятная методы были используется для визуализации белков после электрофореза геля, например с помощью колориметрических красители Кумасси синим, Серебряная пятно, флуоресценции или радиоактивных маркировки^{1,2, 3 , 4}. Серебряный пятнать считается одним из наиболее чувствительных методов для обнаружения белка, требующих простой и дешевый реагентов. Это могут быть разделены на два основных семей: аммиачный Серебряная пятно и нитрата серебра пятно^5,6. В методе щелочной аммиачного серебра серебра диамин комплекс производится с аммиаком и гидроксид натрия и сокращено до металлического серебра во время разработки с помощью решения кислотные формальдегида. Пятно вмещает эффективно для основных белков, но показывает Скомпрометированное представление для кислых и нейтральных белков и, Кроме того, ограничивается классической глицин и таурина электрофоретической систем. В сравнении, нитрата серебра пятна эксплуатировать высокой био близость ионов серебра белка, главным образом сульфгидрильных и карбоксильных групп из боковых цепей и склонны пятно кислые белки более эффективно⁷. После ионов серебра привязки, развивающихся решение (как правило, сделаны из металла карбонат раствор, содержащий формальдегида и натрия тиосульфата) применяется для снижения ионы серебра Металлик серебряный зерна, которые строить коричневого до темного цвета для визуализации белка полосы.

Хотя Серебряные пятная был хорошо известен своей универсальностью и высокой чувствительности с его развития в 1970-х⁸, метод часто рассматривается как сложная. Серебро окрашивание методы имеют ограниченный время шаги и показать низкая воспроизводимость. Поскольку цвет серебряные пятна обычно не является единообразной и зависит от сокращения шаг, который сложно контролировать, Серебряная пятно не количественный метод и, таким образом, не рекомендуется для геля сравнения исследования и белка количественная оценка⁹. Методы оптимизации чувствительности могут использовать альдегидов, которые также могут обеспечить более единообразной пятнать¹⁰. Однако это за счет далее вниз по течению анализ благодаря сшивки белков, альдегиды. Быстрый протоколы главным образом объединить или сократить шаги по сокращению времени, ущерба для воспроизводимости и единообразия пятно⁵. В результате имеются многочисленные Серебряные пятная варианты внутри гель белка, окрашивание, каждый оптимизирована для удовлетворения определенных требований; например простота, чувствительности или пептид ставки возмещения по течению анализа. Эти атрибуты также могут иметь влияние друг на друга, и удовлетворение всех требований в одном протоколе может быть затруднено.

В этой работе мы представляем новый флуоресцентные Серебряный пятнать метод для определения белка в геле полиакриламида. В этом методе мы используем fluorogenic зонд для ионы серебра, ТЭП 4TA (рис. 1), чтобы визуализировать серебро пропитанные белков¹¹. TPE-4TA разработан принцип индуцированной агрегации выбросов (АЕИ). Это не эмиссионные при растворении в водном растворе, но весьма эмиссионных присутствии ионов серебра. Заменив хромогенных развития в традиционные серебряные пятна fluorogenic развивающихся шаг, люминесцентные серебряные метод позволяет надежные пятнать суммарных белков на фоне снижения.

Кроме того люминесцентные серебряные пятна показал хороший линейный динамический диапазон для количественного определения белка, которая сравнима с пятно SYPRO Ruby широко используется и не достижимы с традиционной серебряные пятна. Гель может отражаться на часто используемые гель документации систем с ультрафиолетовой лампой (длина волны возбуждения: 302/365 Нм канал; выбросов: ~ 490-530 Нм) на многих биологических лабораториях.