Fluoreszierende silberne Färbung von Proteinen im Polyacrylamid-Gele

Viele Färbung Methoden wurden verwendet, um Proteine nach Gelelektrophorese, z. B. Verwendung von farbmetrischen Farbstoffen wie Coomassie Brilliant Blue, silbernen Fleck, Fluoreszenz zu visualisieren oder radioaktive Markierung^{1,2, 3 , 4}. silberne Färbung gilt als eines der sensibelsten Techniken für Proteindetektion erfordern einfache und billige Reagenzien. Es kann in zwei große Gruppen unterteilt werden: der ammoniakalischen Silber Fleck und das Silbernitrat Flecken^5,6. In der alkalischen ammoniakalischen Silber-Methode ist der Silber-Diamin-Komplex mit Ammoniak und Natriumhydroxid hergestellt und während der Entwicklung mit einer sauren Formaldehyd-Lösung zu metallischem Silber reduziert. Der Fleck beherbergt effizient für grundlegende Proteine aber zeigt eine kompromittierte Performance für saure und neutrale Proteine und ist darüber hinaus auf klassischen Glycin und Taurin elektrophoretischen Systemen beschränkt. Im Vergleich dazu die Silbernitrat Flecken nutzen die hohe Bio-Affinität von Silberionen an Protein, in erster Linie die Sulfhydryl Carboxylgruppen Gruppen aus den Seitenketten und tendenziell saure Proteine effizienter Fleck⁷. Nach Silberionen verbindlich, eine entwickelnde Lösung (in der Regel aus einer Metall-Karbonat-Lösung, die Formaldehyd und Natrium Thiosulphate) wird angewendet, um die Silberionen zu metallischem Silber Körner zu verringern, die eine braun-dunkel Farbe visualisieren bauen die Protein-Bänder.

Obwohl Silber Färbung bekannt für seine Vielseitigkeit und hohe Empfindlichkeit seit seiner Entwicklung in den 1970er Jahren⁸gewesen, wird die Methode häufig als schwierig angesehen. Silber-Färbung Methoden haben zeitlich begrenzte Schritte und zeigen niedrige Reproduzierbarkeit. Da die Farbe des silbernen Fleck in der Regel nicht ist einheitlich und Reduktionsschritt, die schwer zu kontrollieren ist abhängig, der silberne Fleck ist keine quantitative Methode und somit nicht für Gel Vergleich Studie und Protein Quantifizierung⁹empfohlen. Methoden in der Empfindlichkeit optimiert können Aldehyde verwenden, die auch eine gleichmäßigeren Färbung¹⁰anbieten können. Dies ist jedoch auf Kosten der weiteren nachgeschalteten Analyse durch die Vernetzung von Proteinen durch Aldehyde. Schnelle Protokolle meist kombinieren oder kürzen Sie Schritte zu verkürzen, die Reproduzierbarkeit und Einheitlichkeit der Fleck⁵zu beeinträchtigen. Infolgedessen gibt es zahlreiche Silber Färbung Varianten innerhalb Protein Gel Färbung, jeweils optimiert, um bestimmte Anforderungen zu entsprechen; zum Beispiel, Einfachheit, Sensibilität oder Peptid Verwertungsquote für nachgelagerte Analyse. Diese Attribute haben ebenfalls einen Einfluss auf einander, und erfüllt alle Anforderungen in einem Protokoll kann schwierig sein.

In dieser Arbeit stellen wir eine neue fluoreszierende silberne Färbung Methode zur Proteindetektion Polyacrylamid-Gel. Bei dieser Methode verwenden wir Fluorogenic Sonde für Silberionen, TPE-4TA (Abbildung 1), die Silber-imprägnierte Proteine¹¹zu visualisieren. TPE-4TA richtet sich nach dem Prinzip der Aggregation-induzierte Emission (AIE). Es ist nicht emissiven, in wässriger Lösung aufgelöst, jedoch höchst emissiven in Anwesenheit von Silber-Ionen. Indem die chromogene Entwicklung im traditionellen silbernen Flecken mit einer Fluorogenic Entwicklung Schritt ermöglicht die fluoreszierende silberne Methode die robuste Färbung des gesamten Proteine mit einem reduzierten Hintergrund.

Darüber hinaus zeigte die fluoreszierende silberne Fleck eine gute lineare Dynamik für Protein Quantifizierung, die vergleichbar mit den weit verbreiteten SYPRO Ruby Fleck und mit traditionellen silbernen Flecken nicht erreichbar ist. Das Gel kann auf häufig verwendete Gel-Dokumentation-Systeme mit einer UV-Lampe abgebildet (Erregung Wellenlänge: 302/365 nm Kanal; Emission: ~ 490-530 nm) bei vielen biologischen Labs.