Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels

Vele kleuring methoden zijn gebruikt om te visualiseren van eiwitten na de Elektroforese van het gel, bijvoorbeeld met behulp van colorimetrische kleurstoffen zoals Coomassie briljant blauw, zilver vlek, fluorescentie, of radioactieve labeling van^{1,2, 3 , 4}. Zilveren kleuring wordt beschouwd als een van de meest gevoelige technieken voor de detectie van de eiwitten die eenvoudige en goedkope reagentia. Het kan worden onderverdeeld in twee grote families: de ammoniumstikstof zilveren vlek en de zilvernitraat vlek^5,6. In de alkalische ammoniumstikstof zilveren methode, is de zilver-diamine-complex geproduceerd met ammoniak en natriumhydroxide en gereduceerd tot metallisch zilver tijdens de ontwikkeling met behulp van een zure formaldehyde-oplossing. De vlek herbergt efficiënt voor fundamentele eiwitten maar toont een gecompromitteerde prestaties voor zure en neutrale eiwitten en is bovendien beperkt tot klassieke glycine en taurine elektroforetische systemen. Ter vergelijking: de zilvernitraat vlekken exploiteren de hoge bio-affiniteit van zilver ionen aan proteïne, voornamelijk de sulfaatzuurstof carboxyl groepen van de zijketens en de neiging om vlekken van zure eiwitten efficiënter⁷. Na zilver ion bindend, een derde oplossing (meestal gemaakt van een oplossing van de metalen carbonaat met formaldehyde en natrium thiosulfaat) wordt toegepast ter vermindering van zilver-ionen tot metallisch zilver korrels, die een kleur bruin-naar-dark opbouwen te visualiseren de eiwit bands.

Hoewel zilver kleuring goed-gekend voor zijn veelzijdigheid en hoge gevoeligheid sinds haar ontwikkeling in de jaren 1970-^{8 is}, wordt de methode vaak beschouwd als lastig. Zilver-kleuring methoden hebben tijd-beperkte stappen en reproduceerbaarheid van de lage tonen. Omdat de kleur van de zilveren vlek meestal niet is uniform en afhankelijk van de vermindering van de stap, die moeilijk te controleren is, de zilveren vlek is niet een kwantitatieve methode en, dus, niet aanbevolen voor gel vergelijking studie en eiwit kwantificering⁹. Methoden geoptimaliseerd in gevoeligheid kunnen gebruik maken van aldehyden die kunnen ook zorgen voor een meer uniform kleuring¹⁰. Dit is echter ten koste van verder stroomafwaarts analyse als gevolg van het crosslinking van eiwitten door aldehyden. Snelle protocollen meestal combineren of verkorten stappen ter vermindering van de tijd, de reproduceerbaarheid en de eenvormigheid van de vlek⁵in gevaar te brengen. Dientengevolge, zijn er talrijke zilver kleuring varianten binnen eiwit gel kleuring, elk geoptimaliseerd voor bepaalde wensen; bijvoorbeeld, eenvoud, gevoeligheid, of peptide terugvinding voor downstream-analyse. Deze kenmerken kunnen ook een invloed hebben op elkaar kan, en die voldoen aan alle eisen in één protocol moeilijk.

In dit werk introduceren wij een nieuwe TL silver methode voor de detectie van de eiwitten in polyacrylamidegel kleuring. In deze methode gebruiken we een fluorogenic-sonde voor zilver-ionen, TPE-4TA (Figuur 1), te visualiseren de zilver-geïmpregneerd eiwitten¹¹. TPE-4TA is ontworpen door de aggregatie-geïnduceerde emissie (AIE)-principe. Het is niet-emissieve wanneer opgelost in waterige oplossing, maar is zeer emissieve in aanwezigheid van een zilver-ionen. Door vervanging van de chromogenic ontwikkeling in traditionele zilveren vlekken met een fluorogenic ontwikkeling van de stap, kunt de fluorescerende zilveren methode de robuuste kleuring van totale eiwitten met een beperkte achtergrond.

Bovendien bleek de fluorescerende zilveren vlek een goede dynamisch lineaire bereik voor eiwit kwantificering, die vergelijkbaar is met de veel gebruikte SYPRO Ruby vlek niet haalbaar is met traditionele zilveren vlekken en. De gel kan worden beeld op documentatiesystemen gebruikte gel met een UV-lamp (excitatie golflengte: 302/365 nm kanaal; emissie: ~ 490-530 nm) bij vele biologische labs.