צביעת כסף פלורסנט של חלבונים בג'לים לזיהוי
Summary
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט חלוקה לרמות של פלורסנט חדש מכתים טכניקה לגילוי חלבון סה בג’לים לזיהוי. הפרוטוקול מנצל בדיקה קרינה פלואורסצנטית ספציפיים יון כסף מדליק, אשר מגלה Ag+-חלבון מכלולי ומונע הגבלות מסוימות של כתמי כסף הדפסות כסף מסורתי.
Abstract
צביעת כסף היא טכניקה ערכי צבע מוחלטים בשימוש נרחב כדי להמחיש להקות חלבון בג’לים לזיהוי בעקבות נתרן dodecyl סולפט-לזיהוי בג’ל (מרחביות-עמוד). כתמי כסף קלאסי יש חסרונות מסוימים, כגון רקע מכתים, חלבון המסכן התאוששות, הפארמצבטית נמוך, טווח דינמי צר ליניארי עבור כימות ותאימות מוגבלת עם ספקטרומטר מסה (MS). עכשיו, עם השימוש של בדיקה Ag+ fluorogenic, TPE-4TA, פיתחנו כסף פלורסנט מכתים שיטת עבור הפריט החזותי הכולל חלבון ב לזיהוי ג’לים. הכתם החדש הזה מונע הצעד הפחתת כסף בעייתי כתמי כסף מסורתי. יתר על כן, הכתם כסף פלורסנט מדגים הפארמצבטית טוב, רגישות, כימות ליניארי בזיהוי חלבון, שהופך אותו כתם ג’ל חלבון שימושי ומעשי.
Introduction
שיטות מכתימים רבות היו בשימוש להמחיש חלבונים בעקבות בג’ל, לדוגמה באמצעות ערכי צבע מוחלטים צבעי כחול מבריק Coomassie, הכתם כסף, זריחה, או רדיואקטיבי תיוג1,2, 3 , 4. צביעת כסף נחשב לאחד הטכניקות הרגישים ביותר לגילוי חלבון הדורשים ריאגנטים פשוט וזול. יכולים להיות מסווגים לתוך שתי המשפחות הגדולות: הכתם כסף אמוני, של כסף חנקתי כתם5,6. השיטה כסף אמוני אלקליין, המתחם diamine בכסף הוא הפיק עם אמוניה, סודיום הידרוקסיד והוריד את כסף מטאלי במהלך הפיתוח באמצעות פתרון פורמלדהיד חומצי. הכתם להכיל ביעילות חלבונים בסיסי אבל מציגה הופעה פרוץ חלבונים חומצי ונייטרלי, הוא, יתר על כן, הוגבלו גליצין קלאסית ומערכות electrophoretic טאורין. לשם השוואה, לנצל הכתמים כסף חנקתי הביו-בזיקה גבוהה של יוני כסף לחלבון, בעיקר את sulfhydryl ואת carboxyl קבוצות מכל הכבלים צד ועל נוטים כתם חומצי חלבונים ביעילות רבה יותר7. לאחר יון כסף מחייב, פתרון המתפתח (בדרך כלל ממתכות פתרון קרבונט מתכת המכילים פורמלדהיד, נתרן thiosulphate) מוחל כדי לצמצם את יוני כסף מטאלי גרגירי כסף, אשר לבנות בצבע חום-כדי-כהה כדי להמחיש להקות חלבון.
למרות צביעת כסף היה ידוע שלו רב-תכליתיות, רגישות גבוהה מאז פיתוחה ב שנות השבעים8, השיטה לעתים קרובות נחשב מסובך. שיטות מכתים כסף יש זמן מוגבלת צעדים ולהראות הפארמצבטית נמוכה. מאז צבע הכתם כסף. בדרך כלל לא אחיד ובלתי תלויה השלב צמצום, אשר קשה לשלוט, הכתם כסף היא לא שיטה כמותית, לפיכך, אינה מומלצת ג’ל השוואה המחקר וחלבון כימות9. שיטות אופטימיזציה של רגישות עלולה לנצל את aldehydes אשר יכול גם לספק מדים יותר להכתים10. עם זאת, זה על חשבון הזרם ניתוח נוסף בשל crosslinking של חלבונים על-ידי aldehydes. פרוטוקולים מהיר בעיקר לשלב או לקצר שלבים כדי לצמצם את זמן, להתפשר על הפארמצבטית ואחידות של הכתם5. כתוצאה מכך, ישנם רבים כסף מכתים משתנים בתוך ג’ל חלבון מכתים, כל אחד בצורה מיטבית כדי שיתאימו בדרישות מסוימות; לדוגמה, פשטות, רגישות או פפטיד שחזור קצב לניתוח במורד הזרם. תכונות אלה עשויים גם להשפיע אחד על השני, והוא מספק את כל הדרישות באחד הפרוטוקולים יכול להיות קשה.
בעבודה זו, אנו מציגים כסף פלורסנט חדש מכתים שיטה לגילוי חלבון בג’ל לזיהוי. בשיטה זו, אנו משתמשים בדיקה fluorogenic על יוני כסף, TPE-4TA (איור 1), כדי להמחיש את החלבונים ספוג כסף11. TPE-4TA מיועד על פי. העיקרון הנוצרות על-ידי צבירת פליטה (קובי אשכנזי). זה בלתי-emissive נמס בתמיסה המימית, אבל הוא מאוד emissive בנוכחות יוני כסף. על-ידי החלפת הפיתוח הדפסות כסף בכתמי כסף המסורתי fluorogenic פיתוח שלב, מאפשרת השיטה כסף פלורסנט ההכתמה חזקים של חלבונים הכולל עם רקע מופחת.
יתר על כן, הכתם כסף פלורסנט הראה טווח דינמי טוב ליניארי על כימות חלבון, שהוא דומה עם הכתם עברית בשימוש נרחב וגם לא בר השגה עם כתמי כסף מסורתי. הג’ל יכול לדימות במערכות תיעוד ג’ל נפוץ עם מנורת אולטרה סגול (אורך גל עירור: ערוץ nm 302/365; פליטה: ~ 490-530 ננומטר) במעבדות ביולוגיות רבות.
Protocol
Representative Results
Discussion
המוצג כאן כסף פלורסנט הרומן מכתימה שיטת חלבונים בג’לים לזיהוי. אסטרטגיה זו משלבת כתמי כסף קונבנציונאלי כתמי פלורסנט. מעלליו מכתימים הכריכה סלקטיבי של יון כסף חלבונים כמו כסף אחרים כתמים אך מעסיקה כסף fluorogenic רגישה מאוד בדיקה TPE-4TA כדי להאיר את החלבונים מאוגד כסף. מאז המכשיר fluorogenic <st…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות פטריק צ’אן במרכז לאו וואי מינג תיקוני לרפואה, Institutet קרולינסקה, לתמיכה טכנית שלו. ס י הוא אסיר תודה על התמיכה של מועצת המחקר השבדי (מענק מס 2017-06344).
Materials
LDS Sample Buffer (4X) |
Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagent |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well |
Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Precast gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagent |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagent |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipment |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Equipment |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Sample |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagent |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagent |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagent |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | – | Provides 18.2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | – | Equipment |
Referências
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods. Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).
- Candiano, G., Bruschi, M., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
- Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer. Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).
- Celis, J. E., et al. . Cell Biology: A Laboratory Handbook. , (2006).
- Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels. Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).
- Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview. Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).
- Zhou, M., Yu, L. Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).
- Xie, S., et al. Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining. Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).
- . Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015)
