Summary

באמצעות מערכות רובוטיות כדי לעבד ולהטביע דגימות מאתר חוקן עבור ניתוחים היסטולוגית

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

היעדר סטנדרטיזציה לעיבוד רקמות מאתר מפחית את האיכות של ניתוח histopathological מאתר לעומת דגימות אנושי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע בדיקה histopathological מאתר מודלק, uninflamed הגס רקמות כדי להראות את הכדאיות של מערכות רובוטיות בשימוש שגרתי עבור עיבוד והטבעה דגימות אנושי.

Abstract

ההבנה של מחלות האדם הורחבה במידה רבה בזכות המחקר בבעלי חיים כמודלים. למרות זאת, הערכת histopathological ניסיוניות צריך להיות קפדני ביותר כמו להחיל עבור דגימות אנושי. אכן, הסקת מסקנות אמין ומדויק באופן ביקורתי מושפעת האיכות של רקמות סעיף הכנה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לניתוח histopathological של רקמות מאתר המיישמת מספר פעולות אוטומטיות במהלך ההליך, משלב הכנת הראשונית ועד פרפין הדגימות מאתר. ההפחתה של משתני מתודולוגי באמצעות פרוטוקול קפדני סטנדרטיזציה של שגרות אוטומטיות תורמת האמינות הכוללת של מאתר ניתוח פתולוגי. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר את הניצול של עיבוד ממוכן, הטמעת מערכות רובוטיות, בשימוש שגרתי עבור עיבוד רקמות ופרפין הטבעה של דגימות אנושי, לעבד מאתר דגימות של דלקת מעיים. . נסיים המהימנות של histopathological בחינת רקמות מאתר זה גדל באופן משמעותי עם הקדמה של טכניקות מתוקננת ואוטומטיים.

Introduction

בעשרות השנים האחרונות, פותחו מספר גרסאות ניסיוניות לנתח את המנגנונים פתוגניים שמוביל מחלות אנושיות1,2. כדי להעריך את חומרת המחלה, החוקרים חייבים להעריך את ההשפעה של טיפול וללמוד את הווריאציות אדריכלי cytological, היסטולוגית או הסכום של דלקת3. כדי לבצע על אלה גרסאות ניסיוניות, ניתוח histopathological מפורט נדרשים, לעיתים קרובות השוואה בין דגימות מאתר האנושי4,5.

בנוסף, דגימות האנושית בדרך כלל מעובדים שבוים על ידי מתקני histopathology, מנוסה פתולוגים האנושית דרך סטנדרטית ושיטות histopathological. לעומת זאת, רקמות מאתר בדרך כלל קבוע, מוטבע, נותחו על ידי החוקרים עם ניסיון מוגבל של פרוטוקולים histopathological. האיכות והאמינות של בדיקה histopathological מתחיל עם הכנת קטעי רקמה באיכות גבוהה. מספר גורמים תורמים באופן ביקורתי הגדל או הקטן האיכות של הניתוח הסופי, כולל קיבוע, מאקרוסקופית חלוקתה, עיבוד, שעוות פרפין הטבעה, והטבעה של דגימות6,7.

כל הקטעים מעורבים מניפולציה של המדגם נחשפים שגיאות, כולל שיבוץ ידני של הדגימות ובמידה פחותה יותר, ידני מיקרוטום חלוקתה, מכתים. כיום, התהליך כולו של רקמות מאתר לקראת הערכה היסטולוגית מסתמך על פרוטוקולים של משתנים מעבדה מעבדה ופרוטוקולים ידנית. מטרת מחקר זה היא ליישם מתוקננת פרוטוקולים אוטומטיים כדי להפחית שגיאות ולשינויים בבדיקה histopathological מאתר.

לידע שלנו, נתאר כאן את הפרוטוקולים הראשון בשביל לרקמות אוטומטית לחלוטין עיבוד והטבעה על הערכה היסטולוגית של רקמות מאתר; אלה משמשים באופן שגרתי ביחידות פתולוגיה עבור הבדיקות דגימות תאים של בני. דוגמה מעשית של הכדאיות של השיטה, מודל מאתר של דלקת מעיים נותחה, קרי, המודל קוליטיס כיבית כרונית הנגרמת על ידי הממשל חוזרות ונשנות של לתוספי סודיום סולפט (DSS) מי השתייה8 ,9. ההגדרה ניסיוני מקרוב דומה האדם מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי) מחלות10 מאז שטופלו DSS בעלי חיים מגלים סימנים של דלקת מעיים, למשל, ירידה במשקל, צואה רופף או שלשול ו לקיצור של המעי הגס, כמו גם פיברוזיס 89,,11. כפי שנצפו בחולים אנושיים מחלת המעי הדלקתי, טיפול DSS יוצר קורס מחלה מורכבת. בהקשר זה, הערכות היסטולוגית משוכלל נדרשים להבין את שינוי מעמיק של הארכיטקטורה רקמות. לכן, היישום של הפרוטוקולים שתואר להגברת איכות הכנה מדגם יועיל חוקרים להסתמך על הפרשנות של היסטולוגית וניתוחים immunohistochemical עבור הגדרות ניסיוני מאתר. מאתר ניסיוניות של מחלות האדם המערבים שינויים של האדריכלות רקמות, הנוכחות של רקמת הסלולר לחדור או דלקת ברקמות שונות ואיברים (המעי, המוח, הכבד, העור) יכול להשתמש איכות מוגברת הכנת הדוגמא לבדיקה histopathological.

Protocol

ההליכים בבעלי חיים אושרו על-ידי משרד הבריאות (אימות 127/15, 27/13) איטלקית ועקבתי אחר ההנחיות טיפול בבעלי חיים במכון האירופי לאונקולוגיה IACUC (טיפול בעלי חיים מוסדיים והוועדה שימוש) 1. קוליטיס כיבית כרונית אינדוקציה על ידי המינהל DSS חוזרות ומין נפרד התאימה עכברים 2 קבוצות (טיפו…

Representative Results

ניסיוני קוליטיס כיבית כרונית הנגרמת על ידי הממשל חוזרות ונשנות של DSS במי השתייה הוא מודל מאתר של דלקת מעיים מקרוב הדומה מחלת המעי הדלקתי האנושי8,9. איור 1 מתאר את השפעת הטיפול DSS, כולל קולון קיצור (איור 1 א’), שימ…

Discussion

אנו מנצלים את השלבים אוטומטיות שונות במהלך ההכנות של רקמות מאתר ניתוח histopathologic. פרוטוקול זה מכוון לספק רמזים טכני כדי להגדיל את הפארמצבטית ותקינה של התהליך כולו, ובכך שיפור האיכות הכוללת של הערכת histopathological הסופי. אנחנו ליישם כלים אוטומטיים ושיטות ההכנה והטבעה של רקמות, בשימוש שגרתי פתולוג…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים המחלקה לפתולוגיה של החולים פוליקליניקו (policlinico) IRCCS, מילאנו לתמיכה טכנית, המתקן חיה IEO לסיוע בגידול בעלי חיים.

Materials

Absolute Ethanol anhydrous Carlo Erba 414605 reagent
Absolute ETOH Honeywell 02860-1L reagent
Aluminium Potassium Sulfate SIGMA A6435 reagent
Aniline Blue SIGMA 415049 reagent
carbol Fuchsin SIGMA C4165 reagent
CD11b (clone M1/70) TONBO biosciences 35-0112-U100 antibody
CD20 IHC (clone SA275A11) Biolegend 150403 antibody
CD3 (17A2) TONBO biosciences 35-0032-U100 antibody
CD4 (GK1.5) BD Biosciences 552051 antibody
CD45.2 (clone 104) BioLegend 109837 antibody
CD8 (53-6.7) BD Biosciences 553031 antibody
Citrate Buffer pH 6 10X SIGMA C9999 reagent
Dab Vector Laboratories SK-4100 reagent
DPBS 1X Microgem L0615-500 reagent
DSS TdB Consultancy DB001 reagent
EDTA SIGMA E9884 reagent
EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrate DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker DAKO compreso in GV80011-2
Eosin VWR 1.09844 reagent
F4/80 (clone BM8) BioLegend 123108 antibody
Formalin PanReac 2,529,311,215 reagent
glacial acetic acid SIGMA 71251 reagent
Goat-anti-Rat-HRP Agilent DAKO P0448 antibody
Haematoxylin DIAPATH C0303 reagent
LEICA Rotary microtome (RM2255) Leica RM2255 equipment
Ly6g (clone 1A8) BD Biosciences 551459 antibody
Mercury II Oxide SIGMA 203793 reagent
Omnis Clearify Clearing Agent DAKO CACLEGAL reagent
Omnis EnVision Flex TRS DAKO GV80011-2 reagent
Orange G SIGMA O3756 reagent
Paraffin Sakura 7052 reagent
Peloris LEICA equipment
Percoll SIGMA P4937 reagent
RPMI 1640 without L-Glutamine Microgem L0501-500 reagent
STS020 Leica equipment
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette SAKURA 7022 equipment
Tissue-Tek Automated paraffin embedder Sakura equipment
Xylene J.T.Baker 8080.1000 reagent

Referências

  1. Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
  2. Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
  3. Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
  4. Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
  5. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
  6. Peters, S. R. . A Practical Guide to Frozen Section Technique. , (2010).
  7. Rosai, J. . Rosai and Ackerman’s Surgical Pathology. , (2011).
  8. Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
  9. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
  10. Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
  11. Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).

Play Video

Citar este artigo
Cribiù, F. M., Burrello, C., Tacchi, R., Boggio, F., Ricca, D., Caprioli, F., Ferrero, S., Facciotti, F. Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (143), e58654, doi:10.3791/58654 (2019).

View Video