Summary

Met behulp van Robotic systemen te verwerken en Embed Colon lymfkliertest monsters voor histologisch Analyses

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Gebrek aan standaardisatie voor lymfkliertest bewerking vermindert de kwaliteit van lymfkliertest histopathologisch analyse ten opzichte van menselijke specimens. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van histopathologisch onderzoek van lymfkliertest ontstoken en uninflamed Colon weefsels te tonen van de haalbaarheid van robotic systemen routinematig gebruikt voor het verwerken en menselijke specimens te embedding.

Abstract

Het begrip van ziekten bij de mens is zeer uitgebreid dankzij de studie van diermodellen. Histopathologisch evaluatie van experimentele modellen moet echter zo streng zijn als die toegepast voor menselijke specimens. Inderdaad, betrouwbare en nauwkeurige conclusies te trekken is kritisch beïnvloed door de kwaliteit van het weefsel sectie voorbereiding. Hier beschrijven we een protocol voor histopathologisch analyse van lymfkliertest weefsels die verschillende geautomatiseerde stappen tijdens de procedure, vanaf de eerste voorbereiding implementeert tot de paraffine inbedding van de lymfkliertest monsters. De vermindering van de methodologische variabelen door middel van strenge protocol standaardisatie van geautomatiseerde procedures draagt bij tot meer algemene betrouwbaarheid van lymfkliertest pathologische analyse. In het bijzonder dit protocol beschrijft het gebruik van geautomatiseerde verwerking en insluiten Robotsystemen, routinematig gebruikt voor de verwerking van het weefsel en paraffine inbedding van menselijke specimens, voor het verwerken van lymfkliertest specimens van darmontstekingen. We concluderen dat de betrouwbaarheid van het histopathologisch onderzoek van lymfkliertest weefsels aanzienlijk is verhoogd bij invoering van gestandaardiseerde en geautomatiseerde technieken.

Introduction

In de afgelopen decennia zijn verschillende experimentele modellen ontwikkeld om te ontleden de pathogene mechanismen die leiden tot ziekten bij de mens1,2. Om te beoordelen van de ernst van een ziekte, moeten onderzoekers evalueren het effect van een behandeling en bestuderen de cytologische en histologische architecturale variaties of het bedrag van ontsteking3. Wilt uitvoeren op deze experimentele modellen, zijn gedetailleerde histopathologische analyses nodig, vaak vergelijken lymfkliertest en menselijke monsters4,5.

Bovendien, menselijke specimens worden meestal verwerkt en scoorde door histopathologie kern faciliteiten en ervaren menselijke pathologen via gestandaardiseerd histopathologisch criteria en methoden. Omgekeerd, lymfkliertest weefsels zijn meestal vaste, ingesloten en geanalyseerd door onderzoekers met weinig ervaring van histopathologische protocollen. De kwaliteit en betrouwbaarheid van histopathologisch onderzoek begint met de voorbereiding van hoogwaardige weefselsecties. Verschillende factoren bijdragen kritisch tot de verhoging of verlaging van de kwaliteit van de uiteindelijke analyse, met inbegrip van fixatie, macroscopische afdelen, verwerking, paraffine insluiten, en inbedding van de monsters6,7.

Alle deze passages met betrekking tot manipulatie van het monster zijn onderworpen aan handmatige fouten, met inbegrip van handmatige inbedding van de monsters en, in mindere mate, handmatige microtoom segmenteren en kleuring. Op dit moment berust het hele proces van lymfkliertest weefsel voorbereiding voor histologisch evaluatie op protocollen die van laboratorium tot laboratorium variëren en handmatige protocollen. Het doel van deze studie is om gestandaardiseerde geautomatiseerde protocollen om fouten en variabiliteit in lymfkliertest histopathologisch onderzoek te verminderen.

Om onze kennis beschrijven we hier de eerste protocollen voor volledig geautomatiseerde weefsel verwerking en insluiten voor de histologische evaluatie van lymfkliertest weefsels; deze worden routinematig gebruikt in pathologie eenheden voor de analyses van menselijke specimens. Een praktisch voorbeeld van de haalbaarheid van de methode, een lymfkliertest model van darmontstekingen heeft zijn geanalyseerd, dat wil zeggen, de chronische colitis model veroorzaakt door herhaalde toediening van dextran natriumsulfaat (DSS) in het drinkwater8 ,9. Deze experimentele instelling nauw lijkt op menselijke ontstoken darm ziekten (IBD)10 aangezien DSS-behandelde dieren tekenen van darmontstekingen, bijvoorbeeld gewichtsverlies, losse ontlasting of diarree en verkorting van de dikke darm, alsmede fibrose vertonen 8,9,11. Zoals opgemerkt voor menselijke IBD patiënten, DSS behandeling genereert een complexe ziekte-cursus. In dit verband, uitgebreide histologische evaluaties dienen te begrijpen van de ingrijpende wijziging van de architectuur van het weefsel. Dus, de uitvoering van de beschreven protocollen voor het verhogen van de sample voorbereiding kwaliteit zouden kunnen profiteren van onderzoekers afhankelijk van de interpretatie van histologische en immunohistochemische analyseert voor lymfkliertest experimentele instellingen. Lymfkliertest experimentele modellen van ziekten bij de mens met betrekking tot wijzigingen van de architectuur van weefsel, de aanwezigheid van cellulaire weefsel infiltreren of ontsteking in verschillende weefsels en organen (darm, lever, hersenen, huid) kon gebruiken de betere kwaliteit van de bereiding van de monsters voor histopathologisch onderzoek.

Protocol

Dierlijke procedures werden goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van gezondheid (Auth. 127/15, 27/13) en volgde de dierenverzorgers richtsnoeren van het Europees Instituut voor oncologie IACUC (gebruik Comité en institutionele dier zorg) 1. chronische Colitis inductie door repetitieve DSS administratie Aparte leeftijd en geslacht gematched muizen in 2 groepen (behandeling DSS vs. controle H2O, ten minste 5 muizen nestgenoten per experimentele groep). Beher…

Representative Results

Experimentele chronische colitis geïnduceerd door herhaalde toediening van DSS in het drinkwater is een lymfkliertest model van darmontstekingen vertonen met menselijke IBD8,9. Figuur 1 beschrijft de effecten van DSS behandeling, met inbegrip van de dikke darm verkorten (figuur 1A), een veel gebruikte parameter te scoren de aanwezigheid van DSS-geïnduceerde ontsteking e…

Discussion

Wij gebruiken verschillende geautomatiseerde stappen tijdens de bereiding van lymfkliertest weefsels histopathologische analyseren. Dit protocol heeft tot doel technische tips om de reproduceerbaarheid en de standaardisatie van het hele proces, dus de verbetering van de algehele kwaliteit van de eindevaluatie histopathologisch te verhogen. Wij geautomatiseerde instrumenten en methoden voor de voorbereiding en de inbedding van weefsels, routinematig gebruikt in pathologie kern voorzieningen voor de studie van menselijke s…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken de afdeling pathologie van het ziekenhuis IRCCS Policlinico, Milaan voor technische ondersteuning en de OIE dier faciliteit voor bijstand in de veehouderij.

Materials

Absolute Ethanol anhydrous Carlo Erba 414605 reagent
Absolute ETOH Honeywell 02860-1L reagent
Aluminium Potassium Sulfate SIGMA A6435 reagent
Aniline Blue SIGMA 415049 reagent
carbol Fuchsin SIGMA C4165 reagent
CD11b (clone M1/70) TONBO biosciences 35-0112-U100 antibody
CD20 IHC (clone SA275A11) Biolegend 150403 antibody
CD3 (17A2) TONBO biosciences 35-0032-U100 antibody
CD4 (GK1.5) BD Biosciences 552051 antibody
CD45.2 (clone 104) BioLegend 109837 antibody
CD8 (53-6.7) BD Biosciences 553031 antibody
Citrate Buffer pH 6 10X SIGMA C9999 reagent
Dab Vector Laboratories SK-4100 reagent
DPBS 1X Microgem L0615-500 reagent
DSS TdB Consultancy DB001 reagent
EDTA SIGMA E9884 reagent
EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrate DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker DAKO compreso in GV80011-2
Eosin VWR 1.09844 reagent
F4/80 (clone BM8) BioLegend 123108 antibody
Formalin PanReac 2,529,311,215 reagent
glacial acetic acid SIGMA 71251 reagent
Goat-anti-Rat-HRP Agilent DAKO P0448 antibody
Haematoxylin DIAPATH C0303 reagent
LEICA Rotary microtome (RM2255) Leica RM2255 equipment
Ly6g (clone 1A8) BD Biosciences 551459 antibody
Mercury II Oxide SIGMA 203793 reagent
Omnis Clearify Clearing Agent DAKO CACLEGAL reagent
Omnis EnVision Flex TRS DAKO GV80011-2 reagent
Orange G SIGMA O3756 reagent
Paraffin Sakura 7052 reagent
Peloris LEICA equipment
Percoll SIGMA P4937 reagent
RPMI 1640 without L-Glutamine Microgem L0501-500 reagent
STS020 Leica equipment
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette SAKURA 7022 equipment
Tissue-Tek Automated paraffin embedder Sakura equipment
Xylene J.T.Baker 8080.1000 reagent

Referências

  1. Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
  2. Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
  3. Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
  4. Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
  5. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
  6. Peters, S. R. . A Practical Guide to Frozen Section Technique. , (2010).
  7. Rosai, J. . Rosai and Ackerman’s Surgical Pathology. , (2011).
  8. Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
  9. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
  10. Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
  11. Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).

Play Video

Citar este artigo
Cribiù, F. M., Burrello, C., Tacchi, R., Boggio, F., Ricca, D., Caprioli, F., Ferrero, S., Facciotti, F. Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (143), e58654, doi:10.3791/58654 (2019).

View Video