Summary

로봇 시스템을 사용 하 여 처리 하 고 저 승 Murine 샘플 조직학 분석 포함

Published: January 07, 2019
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Summary

Murine 조직 처리에 대 한 표준화의 부족 인간의 표본에 비해 murine histopathological 분석의 품질을 줄일 수 있습니다. 여기, 선물이 murine 염증 및 uninflamed 저 승 조직 처리 및 인간의 샘플을 포함에 대 한 정기적으로 사용 하는 로봇 시스템의 타당성을 보여의 histopathological 검사를 수행 하는 프로토콜.

Abstract

인간의 질병의 이해 동물 모델의 연구 덕분에 크게 확장 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 실험 모델의 histopathological 평가 인간의 샘플에 대 한 적용으로 엄격한 될 필요가 있다. 실제로, 안정적이 고 정확한 결론 비판적으로 조직 섹션 준비의 품질에 의해 좌우 된다. 여기, 우리 histopathological 분석 murine 조직 절차 동안, murine 샘플의 파라핀 포함에 초기 준비에서 몇 가지 자동화 된 단계를 구현 하는 프로토콜을 설명 합니다. 자동화 된 절차에서 엄격한 프로토콜 표준화를 통한 방법론 변수 감소 murine 병 적인 분석의 향상 된 전반적인 안정성에 기여 한다. 특히,이 프로토콜 자동된 처리의 활용에 설명 합니다 하 고 조직 처리 및 파라핀 인간의 샘플의 포함 murine 표본 장 염증의 처리를 정기적으로 사용 로봇 시스템을 포함. 우리는 murine 조직의 histopathological 검사의 신뢰성 표준화 하 고 자동화 된 기법의 도입에 따라 크게 증가 결론.

Introduction

마지막 십 년간에서 인간의 질병1,2를 선도 하는 병원 성 메커니즘을 해 부를 몇 가지 실험 모델 개발 되었습니다. 질병의 심각도 평가, 연구원은 처리의 효과 평가 하 고 cytological 및 조직학 건축 변화 또는 염증3양의 공부 해야 합니다. 그 실험 모델을 사용 하 여 수행 하려면 자세한 histopathological 분석 murine 인간과 샘플4,5종종 비교 필요 하다.

또한, 인간의 샘플 일반적으로 처리 되 고 histopathology 핵심 시설에 의해 득점 하 고 경험이 인간의 병리학을 통해 표준화 histopathological 기준 및 방법. 반대로, murine 조직은 보통 고정, 임베디드 및 histopathological 프로토콜의 제한 된 경험을 가진 연구원에 의해 분석. 품질 및 histopathological 검사의 신뢰성 높은 품질 조직 단면도의 준비로 시작 합니다. 여러 가지 요인을 비판적으로 증가 또는 감소 등 고정, 거시적인 최종 분석의 품질 구분, 처리, 파라핀, 포함 및 샘플6,7의 포함에 기여.

샘플의 조작 관련 된 이러한 모든 구절 수동 샘플의 포함을 포함 하 여 수동 오류 및 낮은 범위, 단면 및 얼룩 수동 톰 대상이 됩니다. 현재, 조직학 평가 murine 조직 준비의 모든 과정은 다양 한 연구소에서 실험실 프로토콜 및 수동 프로토콜 의존 합니다. 이 연구의 목표 오류와 murine histopathological 시험에 다양성을 줄이기 위해 표준화 자동화 프로토콜을 구현 하는 것입니다.

우리의 지식, 여기 완전 자동된 조직 처리 및 murine 조직;의 조직학 평가 대 한 포함에 대 한 첫 번째 프로토콜 설명 이러한 인간의 표본 분석에 대 한 병 리 단위에서 정기적으로 사용 됩니다. 방법의 타당성의 실용적인 예를 들어, 창 자 염증의 murine 모델 분석 된, 즉, , 만성 대 장 염 모델으로 인 한 식 수8 에서에서 dextran 나트륨 황산 염 (DSS)의 반복된 관리 9. DSS 처리 동물 예를 들면, 체중 감소, 느슨한 대변 또는 설사, 및 섬유 증 뿐만 아니라 콜론의 단축 창 자 염증의 표시를 전시 하기 때문에 인간의 선 동적인 장 질병 (IBD)10 유사한 밀접 하 게이 실험 설정 8,,911. 인간의 IBD 환자에 대 한 관찰, DSS 처리는 복잡 한 질병 과정을 생성 합니다. 이러한 맥락에서 정교한 조직학 평가 조직 아키텍처의 심오한 변화를 이해 해야 합니다. 따라서, 샘플 준비 품질을 높이기 위한 기술된 프로토콜의 구현 조직학의 해석에 의존 하는 연구자를 유익할 수 있습니다 고 immunohistochemical murine 실험 설정에 대 한 분석. 조직 구조의 변경에 관련 된 인간 질병의 murine 실험 모델, 세포 조직 침투 또는 다른 조직 및 장기 (내장, 뇌, 간, 피부)에 염증의 존재의 증가 품질 사용할 수 있는 histopathological 검사를 위한 샘플 준비입니다.

Protocol

동물 건강 (Auth. 127/15, 27/13)의 이탈리아 정부에 의해 승인 과정과 종양학 IACUC (기관 동물 관리 및 사용 위원회)의 유럽 연구소의 동물 보호 지침을 따라 1. 만성 대 장 염 유도 반복 DSS 관리 별도 연령과 성별 쥐 2 그룹 (치료 DSS 제어 H2O 대, 실험적인 그룹 당 적어도 5 쥐 littermates)에 일치합니다. 2.5% 관리 DSS (40 kDa) 치료 그룹에 7 일 및 물 컨트롤 그룹에 대 ?…

Representative Results

식 수에 DSS의 반복 된 관리에 의해 유도 된 실험 만성 대 장 염은 밀접 하 게 닮은 인간 IBD8,9장 염증의 murine 모델. 그림 1 은 콜론 단축 (그림 1A), DSS 유도 된 염증의 존재와 저 승 식 프로-염증 성 유전자 CXCL10 등의 점수를 널리 사용 매개 변수를 포함 한 DSS 치료의 효과를 설명 합니?…

Discussion

우리 조직 분석 murine 조직의 준비 하는 동안 다른 자동화 된 단계를 사용합니다. 이 프로토콜 기술 힌트 재현성 및 따라서 최종 histopathological 평가의 전반적인 품질을 향상 하는 전체 과정의 표준화를 제공 하는 것을 목표로. 우리는 자동된 계기와 준비 및 조직, 정기적으로 인간의 표본 연구에 대 한 병 리 핵심 시설에 사용의 포함에 대 한 메서드 구현.

이 방법의 잠재적인 적?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

IRCCS 폴 병원, 기술 지원에 대 한 밀라노와 IEO 동물 시설 지원에 대 한의 병 리의 부를 축산에는 감사합니다.

Materials

Absolute Ethanol anhydrous Carlo Erba 414605 reagent
Absolute ETOH Honeywell 02860-1L reagent
Aluminium Potassium Sulfate SIGMA A6435 reagent
Aniline Blue SIGMA 415049 reagent
carbol Fuchsin SIGMA C4165 reagent
CD11b (clone M1/70) TONBO biosciences 35-0112-U100 antibody
CD20 IHC (clone SA275A11) Biolegend 150403 antibody
CD3 (17A2) TONBO biosciences 35-0032-U100 antibody
CD4 (GK1.5) BD Biosciences 552051 antibody
CD45.2 (clone 104) BioLegend 109837 antibody
CD8 (53-6.7) BD Biosciences 553031 antibody
Citrate Buffer pH 6 10X SIGMA C9999 reagent
Dab Vector Laboratories SK-4100 reagent
DPBS 1X Microgem L0615-500 reagent
DSS TdB Consultancy DB001 reagent
EDTA SIGMA E9884 reagent
EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrate DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker DAKO compreso in GV80011-2
Eosin VWR 1.09844 reagent
F4/80 (clone BM8) BioLegend 123108 antibody
Formalin PanReac 2,529,311,215 reagent
glacial acetic acid SIGMA 71251 reagent
Goat-anti-Rat-HRP Agilent DAKO P0448 antibody
Haematoxylin DIAPATH C0303 reagent
LEICA Rotary microtome (RM2255) Leica RM2255 equipment
Ly6g (clone 1A8) BD Biosciences 551459 antibody
Mercury II Oxide SIGMA 203793 reagent
Omnis Clearify Clearing Agent DAKO CACLEGAL reagent
Omnis EnVision Flex TRS DAKO GV80011-2 reagent
Orange G SIGMA O3756 reagent
Paraffin Sakura 7052 reagent
Peloris LEICA equipment
Percoll SIGMA P4937 reagent
RPMI 1640 without L-Glutamine Microgem L0501-500 reagent
STS020 Leica equipment
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette SAKURA 7022 equipment
Tissue-Tek Automated paraffin embedder Sakura equipment
Xylene J.T.Baker 8080.1000 reagent

Referências

  1. Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
  2. Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
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  11. Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).

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Citar este artigo
Cribiù, F. M., Burrello, C., Tacchi, R., Boggio, F., Ricca, D., Caprioli, F., Ferrero, S., Facciotti, F. Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (143), e58654, doi:10.3791/58654 (2019).

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