Isolement des thylakoïdes physiologiquement actives et leur utilisation dans des essais de Transport protéine dépendant de l’énergie
Summary
Nous présentons des protocoles ci-après pour l’isolement de haut rendement de thylakoïdes physiologiquement actives et essais de transport de protéine pour la translocation de chloroplastes twin arginine (cpTat), sécrétoire (cpSec1) et particules (cpSRP) voies de reconnaissance des signaux.
Abstract
Les chloroplastes sont les organites en plantes vertes chargées d’effectuer de nombreuses voies métaboliques essentielles, notamment de la photosynthèse. Dans les chloroplastes, le système de membrane de thylakoid abrite tous les pigments photosynthétiques, complexes de centre de réaction et la plupart des transporteurs d’électrons et est responsable de la synthèse d’ATP dépendante de la lumière. Plus de 90 % des protéines de chloroplastes sont codées dans le noyau, traduit dans le cytosol et ensuite importé dans le chloroplaste. Transport des protéines supplémentaire dans ou à travers la membrane des thylakoïdes utilise une des quatre voies de translocation. Nous décrivons ici une méthode de rendement élevé pour l’isolement des thylakoïdes transport-compétente de pois (Pisum sativum), ainsi que des essais de transport à travers les trois dépendant de l’énergie cpTat et cpSec1 cpSRP par l’intermédiaire des voies. Ces méthodes permettent des expériences relatives à la localisation des protéines thylakoïdes, transport énergétique et les mécanismes de la translocation de la protéine à travers les membranes biologiques.
Introduction
La quasi-totalité de la machinerie protéique responsable fonction chloroplastes appropriée doit être transloquée dans le cytosol1. L’enveloppe de chloroplaste, substrats protéiques sont importés par le translocon de la membrane externe (TOC) et le translocon de la membrane interne (TIC)2. Ciblage plus loin pour les thylakoïdes membrane et lumen se fait par les jumeaux arginine translocation (cpTat)3, la sécrétion (cpSec1)4, le signal reconnaissance particule (cpSRP)5et les voies d’insertion spontanée6 . Une méthode pour l’isolation de haut rendement des chloroplastes physiologiquement actives et les membranes thylakoïdes est nécessaire de mesurer le bilan énergétique et cinétique d’un événement de translocation, de comprendre les mécanismes de transport diversifié dans chaque voie et à localiser un substrat protéique particulière d’intérêt à l’un des six compartiments distincts du chloroplaste.
L’isolement des membranes des chloroplastes offre mieux expérimentale maîtrise des facteurs environnementaux (tels que les concentrations de sel et de substrat, la présence d’ATP/GTP et des conditions de pH) qui influent sur la mesure de l’énergétique du transport et cinétique. Cet environnement in vitro se prête à l’exploration des détails mécaniques de translocation pour les mêmes raisons. En outre, logiciel prédictif pour la localisation des protéines de chloroplastes s’est améliorée7,8, essais in vitro de transport prévoient une méthode plus rapide pour la confirmation sur la microscopie fluorescentes analyses que besoin d’une balise fluorescente génétiquement encodée, la transformation des plantes et/ou des anticorps spécifiques. Nous présentons ici les protocoles pour l’isolement des chloroplastes et des thylakoïdes des pois (Pisum sativum), ainsi que pour des essais de transport optimisés pour chacune des voies translocation thylakoïdes dépendant de l’énergie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolement des chloroplastes et des thylakoïdes
Rupture d’excessive peut entraîner dans les chloroplastes pauvres isolement et donc pauvre thylakoïdes rendement après la séparation du gradient. Il est préférable d’homogénéiser les tissus récoltés délicatement en veillant à ce que tout le matériel est immergé avant de mélanger et pulsé dans 15 s cycles jusqu’à ce que complètement homogénéisée. Si nécessaire, utilisez plusieurs tours plus courtes de mélanger avec moins de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce manuscrit a été préparé avec le financement par la Division des Sciences chimiques, sciences de la terre et Biosciences, bureau 408 énergie des Sciences de base de l’US Department of Energy par Grant DE-SC0017035
Materials
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 – Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
Referências
- Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).
- Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. Protein transport into chloroplasts. Annual review of plant biology. 61, (2010).
- Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
- Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
- Dabney-Smith, C., Storm, A. . Plastid Biology. , 271-289 (2014).
- Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
- Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
- Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).
- Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).
- Lo, S. M., Theg, S. M. . Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).
- Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
- Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
- Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
- Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
- Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
- Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
- Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
- Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
- Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
- Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
- Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Bioquímica. 43 (45), 14508-14516 (2004).
- Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
- Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).
