생리 적으로 활성 Thylakoids 및 에너지 의존 단백질 수송 분석 실험에 있는 그들의 사용의 격리
Summary
선물이 여기 순수 active thylakoids의 높은 수율 격리에 대 한 프로토콜 및 엽록체 트윈 아르기닌 전 (cpTat), 분 비 (cpSec1), 및 신호 승인 입자 (cpSRP) 경로 대 한 단백질 전송 분석 실험.
Abstract
엽록체는 녹색 식물 수많은 필수 대사 경로, 수행에 대 한 책임에서 세포 특히 광합성. 엽록체, 내 thylakoid 막 시스템 모든 광합성 안료, 반응 센터 복합물, 및 전자 통신 사업자의 대부분 이며 빛 종속 ATP 합성에 대 한 책임. 엽록체 단백질의 90% 이상 핵에서 인코딩, cytosol, 번역 이며 이후에 엽록체를 가져올. 추가 단백질 전송 또는 thylakoid 막에 걸쳐 4 전 경로 중 하나를 사용합니다. 여기, 우리 3 에너지 종속 cpTat, cpSec1, 및 cpSRP 중재 경로 통해 전송 분석 함께 완두콩 (Pisum sativum)에서 전송 유능한 thylakoids의 격리에 대 한 높은 수확량 메서드를 설명합니다. 이러한 메서드를 실험 생물학 막에 걸쳐 thylakoid 단백질 지 방화, 교통에 너 지론, 그리고 단백질 전 좌의 메커니즘에 관련 된 사용.
Introduction
배치할 기계 적절 한 엽록체 기능에 대 한 책임의 거의 모든 cytosol1translocated 해야 합니다. 엽록체 봉투에서 단백질 기판의 외부 막 (TOC) translocon와 내부 막 (TIC)2의 translocon를 통해 가져올 수 있습니다. 더는 thylakoid에 타겟팅 막과 루멘 트윈 아르기닌 전 (cpTat)3,4분 비 (cpSec1), 신호 승인 입자 (cpSRP)5, 그리고 자발적인 삽입 경로6 통해 발생 . 순수 활성 엽록체 및 thylakoid 막의 높은 수율 격리에 대 한 메서드는 필요한에 너 지론과 전 이벤트, 각 통로에 다양 한 전송 메커니즘을 이해 하 고 지역화의 활동을 측정 하는 엽록체의 6 가지 구획에 관심의 특정 단백질 기질.
더 나은 실험 제어 전송에 너 지론의 측정에 영향을 주는 환경 요인 (예: 소금, 기질 농도, pH 조건과 ATP/GTP의 존재)를 제공 하는 엽록체에서 막의 분리 및 속도 론입니다. 이 체 외에서 환경에 빌려준다 전 좌의 기계적 세부 탐사 같은 이유로. 또한, 엽록체 단백질의 지역화에 대 한 예측 소프트웨어7,8개선 했다, 하는 동안 전송 분석 생체 외에서 제공 확인에 대 한 더 빠른 방법 현미경-기반 형광 분석을 인코딩된 유전자 형광 태그, 공장 변환 및 특정 항 체를 필요 합니다. 여기, 엽록체 및 thylakoid 격리 완두콩 (Pisum sativum)에서 뿐만 아니라 에너지 의존 thylakoid 전 좌 통로의 각각에 최적화 된 전송 분석 실험 프로토콜 선물이.
Protocol
Representative Results
Discussion
엽록체 및 Thylakoid 절연
과도 한 파손 될 수 있습니다 가난한 엽록체에서 격리 하 고 따라서 가난한 thylakoid에서에서 분리 후 항복. 그것은 모든 재료 혼합 및 완전히 무 균 때까지 15 s 사이클에서 펄스 전에 침수는 함으로써 부드럽게 수확된 조직 균질 최고의. 필요한 경우 여러 개의 짧은 라운드의 각 라운드에서 적은 조직으로 혼합 사용 합니다.
수확된 조직…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 원고는 화학 과학의 부, Geosciences, 생물 과학, 미국 에너지 부 통해 부여 드-SC0017035의 기본적인 에너지 과학의 408 사무실에 의해 자금으로 준비 된
Materials
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 – Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
Referências
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