בידוד של פעיל מבחינה פיזיולוגית Thylakoids, השימוש בהם במסגרת מבחני תחבורה אנרגיה תלוית חלבון
Summary
אנו מציגים פרוטוקולים בזאת לבידוד לתפוקה גבוהה של פעיל מבחינה פיזיולוגית thylakoids, חלבון מבחני תחבורה עבור רוברטסונית ארגינין טווין כלורופלסט (cpTat), הפרשה (cpSec1), אות זיהוי החלקיקים (cpSRP) מסלולים.
Abstract
מהכלורופלסט הן organelles בצמחים ירוקים אחראי על ביצוע מסלולים מטבוליים חיוניים רבים, ובראשם פוטוסינתזה. בתוך בתורה מהכלורופלסט, מערכת קרום תילקואיד בתים כל הפיגמנטים פוטוסינתטיים, מתחמי מרכז התגובה, ואת רוב נשאי האלקטרונים, אחראי על סינתזת ATP האור תלוי. מעל 90% של כלורופלסט חלבונים מקודד בגרעין, המתורגמת את ציטוזול, לאחר מכן לייבא לתוך כלורופלסט. תחבורה חלבון נוספת או על פני קרום תילקואיד מנצל לאחד ארבעה מסלולים טרנסלוקציה. כאן, אנו מתארים שיטה תשואה גבוהה עבור בידוד של תחבורה-מוסמך thylakoids של אפונה (אפון השדה), יחד עם תחבורה מבחני דרך שלושה תלויי-אנרגיה cpTat, cpSec1, מסלולים בתיווך cpSRP. שיטות אלה מאפשרות ניסויים הקשורים תילקואיד חלבון לוקליזציה תחבורה energetics, המנגנון של טרנסלוקציה של חלבונים על פני מחקר ביולוגי.
Introduction
כמעט את כל המכונות proteinaceous אחראי לתפקוד תקין כלורופלסט חייב להיות translocated מ ה ציטוזול1. על המעטפות כלורופלסט, חלבון סובסטרטים מיובאים דרך את translocon של הממברנה החיצונית (TOC), את translocon של הממברנה הפנימית (טיק)2. המיקוד עוד יותר תילקואיד ממברנה ו לומן מתרחשת דרך טווין ארגינין טרנסלוקציה (cpTat)3, את הפרשה (cpSec1)4, אות זיהוי החלקיקים (cpSRP)5, המסלולים ההכנסה ספונטנית6 . שיטת הבידוד לתפוקה גבוהה של פעילות פיזיולוגית מהכלורופלסט וממברנות תילקואיד יש צורך למדוד את energetics ואת קינטיקה של אירוע רוברטסונית, להבין את מנגנוני ההעברה מגוונים בכל מסלול, וכדי להתאים לשפה לסובסטרט חלבון מסוים מכל ששת התאים ברורים של כלורופלסט עניין.
בידודו של ממברנות של כלורופלסט מציע כדאי ניסיוני שליטה על גורמים סביבתיים (כגון: ריכוזי מלח ואת המצע, הנוכחות של ATP/GTP, ותנאי pH) המשפיעים על המדד של תחבורה energetics, קינטיקה. סביבה זו במבחנה הוא משאיל את עצמו חקר מכניסטית בפרטי רוברטסונית מאותן סיבות. בנוסף, בעוד תוכנה חזוי עבור לוקליזציה של כלורופלסט חלבונים השתפרה7,8, in vitro לקשרי תחבורה מבחני לספק שיטה מהירה יותר עבור אישור על מבחני פלורסנט מבוסס מיקרוסקופיה דורשים תגית פלורסנט מקודדים גנטית, צמח שינוי ו/או נוגדנים ספציפיים. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים ומשום כלורופלסט, תילקואיד של אפונה (אפון השדה), כמו גם עבור מבחני תחבורה ממוטב עבור כל אחד המסלולים רוברטסונית תילקואיד תלויי-אנרגיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בידוד כלורופלסט, תילקואיד
שבירה מוגזמת עלולה לגרום ב כלורופלסט המסכן בידוד ובכך תילקואיד המסכן תשואות לאחר ההפרדה במעבר הצבע. מומלץ homogenize את הרקמה שנקטפו בעדינות על-ידי הבטחת כי כל החומר שקוע לפני המיזוג, הפועמים 15 מחזורים s ובודקים באופן מלא. אם יש צורך, להשתמש מספר סיבובים ק…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
כתב יד זה הוכן עם מימון על ידי חלוקה של מדעי הכימיה, מדעי החיים, 408 משרד האנרגיה הבסיסית, למדעי לנו מחלקת האנרגיה דרך גרנט דה-SC0017035
Materials
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 – Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
Referências
- Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).
- Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. Protein transport into chloroplasts. Annual review of plant biology. 61, (2010).
- Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
- Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
- Dabney-Smith, C., Storm, A. . Plastid Biology. , 271-289 (2014).
- Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
- Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
- Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).
- Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).
- Lo, S. M., Theg, S. M. . Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).
- Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
- Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
- Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
- Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
- Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
- Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
- Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
- Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
- Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
- Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
- Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Bioquímica. 43 (45), 14508-14516 (2004).
- Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
- Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).
