प्रौढ़ छल्ली के माध्यम से टयूब Drosophila लेग मोटर न्यूरॉन Axons
Summary
यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए निर्धारण, बढ़ते, इमेजिंग, और बाद इमेजिंग कदम से Drosophila के वयस्क पैरों में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लक्ष्यीकरण axonal कल्पना ।
Abstract
ंयूरॉन विनिर्देशन पर काम के बहुमत इस तरह सीके रूप में आनुवंशिक रूप से और शारीरिक रूप से परितंत्रीय मॉडल में किया गया है एलिगेंस, Drosophila लार्वा, और मछली, जो सभी undulatory आंदोलनों में संलग्न है (जैसे रेंगने या तैराकी) गतिवान के अपने प्राथमिक मोड के रूप में । हालांकि, व्यक्तिगत मोटर ंयूरॉन (MN) विनिर्देश के एक और अधिक परिष्कृत समझ-कम से कम रोग चिकित्सा सूचना के संदर्भ में-एक समान रूप से परितंत्रीय प्रणाली की मांग है कि बेहतर मॉडल जटिल संलग्न-आधारित गतिवान योजनाओं की रीढ़. चलने के आरोप में वयस्क Drosophila हरकत प्रणाली आसानी से इन मानदंडों के सभी मिलता है, इस मॉडल में आसानी से विशिष्ट पैर mns की एक छोटी संख्या के विनिर्देशन का अध्ययन करने के लिए संभव है (लगभग ५० mns प्रति पैर) दोनों एक विशाल का उपयोग शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों की सरणी, और एक संलग्न के शारीरिक संदर्भ में आधारित गतिवान योजना । यहाँ हम एक वयस्क मक्खी में पैर की मांसपेशी इन्नेर्वतिओन कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.
Introduction
हड्डीवाला अंग की तरह, Drosophila वयस्क पैर क्षेत्रों में आयोजित किया जाता है । प्रत्येक मक्खी पैर में 14 मांसपेशियों, जिनमें से प्रत्येक कई मांसपेशी फाइबर1,2शामिल हैं । वयस्क पैर MNs के सेल निकायों T1 (वक्ष), टी 2 (mesothoracic), और T3 (metathoracic) गैंग्लिया ventral तंत्रिका कॉर्ड (VNC), एक संरचनात्मक हड्डीवाला रीढ़ की हड्डी (चित्रा 1) के अनुरूप के प्रत्येक पक्ष पर स्थित हैं । प्रत्येक गैंग्लिया में लगभग ५० MNs हैं, जो ipsilateral लेग (coxa, trochanter, फीमर, और टिबिया) (चित्रा 1)3के चार खंडों में मांसपेशियों को लक्षित करते हैं । महत्वपूर्ण बात, प्रत्येक व्यक्ति वयस्क लेग MN एक अद्वितीय रूपात्मक पहचान है कि अत्यधिक3,4जानवरों के बीच तोडऩे की है । ये सभी अनूठे अजेंडे 11 स्टेम सेल से प्राप्त हुए हैं, जिन्हें neuroblasts (NBs) लार्वा चरण3,4के दौरान लेग मनसे का उत्पादन कहा जाता है । लार्वा चरणों के अंत में सभी अपरिपक्व postmitotic मनसे उनके विशिष्ट वृक्ष arbors और axonal टर्मिनल लक्ष्य है कि उनके अद्वितीय आकृति विज्ञान3,4को परिभाषित प्राप्त करने के लिए कायापलट के दौरान अंतर । पहले हम परिकल्पना का परीक्षण किया है कि एक मिश्रित कोड प्रतिलेखन कारकों (TFs) प्रत्येक Drosophila वयस्क लेग MN5की अद्वितीय आकृति विज्ञान निर्दिष्ट करता है । एक मॉडल के रूप में, हम वंश बी, 11 नायब वंश जो सात अजेंडे से बाहर पैदा करता है और प्रदर्शन किया है कि postmitotic वयस्क पैर MNs में व्यक्त की TFs के एक मिश्रित कोड का इस्तेमाल उनके व्यक्तिगत morphologies हुक्म । एमएनएस के TF कोड को फिर से प्रोग्राम करके हम मार्लोन morphologies को पूर्वानुमानित तरीके से स्विच करने में सफल रहे हैं । हम इन tfs: mTFs (रूपात्मक tfs)5कहते हैं ।
वयस्क MNs के रूपात्मक विश्लेषण के सबसे चुनौतीपूर्ण भागों में से एक उच्च संकल्प के साथ एक मोटी और ऑटो फ्लोरोसेंट छल्ली के माध्यम से axons कल्पना है । हम आमतौर पर एक झिल्ली-टैग GFP है कि एक द्विआधारी अभिव्यक्ति प्रणाली के साथ MNs में व्यक्त की है के साथ axons लेबल, जैसे DVglut-Gal4/यूएएस-mCD8:: GFP या DVglut-QF/QUAS mCD8:: GFP, जहां DVglut में व्यक्त एक मजबूत चालक है motoneurons6. इस तरह के एक repressible मार्कर (MARCM)7, सीआईएस-MARCM8, या MARCMbow5के साथ मोज़ेक विश्लेषण के रूप में अन्य क्लोनिक तकनीकों के साथ इन उपकरणों के संयोजन से, हम GFP विश्लेषण कर एमएनएस के उपजनसंख्याों को phenotypic अभिव्यक्ति सीमित कर सकते हैं की axons आसान है । हम एक प्रोटोकॉल उत्पंन करने के लिए लेग MN axonal आकृति विज्ञान के लिए बरकरार रखने के लिए इमेजिंग और विशिष्ट मुद्दों को संबोधित द्वारा बाद में 3 डी पुनर्निर्माण इस तरह के रूप में वयस्क Drosophila पैर को आंतरिक (1) वयस्क पैर की आंतरिक संरचनाओं के निर्धारण axon आकृति विज्ञान, अंतर्जात फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति को प्रभावित किए बिना, और पैर पेशियां, (2) पैर के बढ़ते एक coverslip के तहत समग्र संरचना को बनाए रखने के लिए और इमेजिंग के लिए उपयुक्त अभिविंयास में, और (3) छवि प्रसंस्करण छल्ली प्राप्त करने के लिए पृष्ठभूमि के रूप में अच्छी तरह से axonal फ्लोरोसेंट संकेत । हालांकि इस प्रोटोकॉल MN axons में फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए विस्तृत किया गया है, यह arthropods में पैर neuromusculature के अंय घटकों कल्पना लागू किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
वयस्क Drosophila के छल्ली और अंय arthropods, जो कई काले pigments शामिल हैं, उनके शरीर के अंदर संरचनाओं को देखने के लिए एक बड़ी बाधा है । इसके अलावा, यह दृढ़ता से ऑटो फ्लोरोसेंट जो खराब निर्धारण के द्वारा किया जाता है । इन दो स…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मक्खी खाद्य माध्यम की तैयारी के लिए रॉबर्ट Renard धंयवाद । यह काम ALS एसोसिएशन (#256), FRM (#AJE20170537445) और ातिप-Avenir कार्यक्रम से J.E. करने के लिए R.S.M. और वित्त पोषण के लिए एक NIH अनुदान NS070644 द्वारा समर्थित किया गया था
Materials
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100×85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22×22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
Referências
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