Visualiser les Drosophila jambe axones des motoneurones à travers la cuticule de l’adulte
Summary
Nous décrivons ici un protocole afin de visualiser le ciblage axonale avec une protéine fluorescente dans jambes adultes de la drosophile par fixation, montage, imagerie et imageries après étapes.
Abstract
La majorité du travail sur la spécification neuronale a été effectuée dans des modèles génétiquement et physiologiquement docile comme C. elegans, des larves de drosophile et poisson, qui tous s’engager dans des mouvements ondulatoires (comme ramper ou natation) comme leur principal mode de locomotion. Toutefois, un plus sophistiqué de compréhension de la spécification individuelle des motoneurones (MN) — au moins en ce qui concerne l’informant des thérapies pour les maladies — exige un système tout aussi docile qui modélise mieux les schémas complexes de locomotion axée sur l’appendice de vertébrés. Système locomoteur drosophile adult responsable marche répond à tous ces critères avec facilité, étant donné que dans ce modèle, il est possible d’étudier la spécification d’un petit nombre de jambe se distingue facilement MNs (environ 50 MNs par jambe) fois en utilisant un vaste Tableau de puissants outils génétiques et dans le contexte physiologique d’un système de locomotion axée sur les appendices. Nous décrivons ici un protocole afin de visualiser l’innervation musculaire de la jambe dans une mouche adulte.
Introduction
Comme la branche de vertébrés, les jambes chez l’adulte de drosophile est organisée en segments. Chaque jambe mouche contient 14 muscles, dont chacun est composé de plusieurs fibres musculaires1,2. Les corps cellulaires de la MNs de jambes chez l’adulte se trouvent dans le T1 (prothoracique), T2 (mésothoracique) et T3 (métathoraciques) ganglions sur chaque côté du cordon nerveux ventral (VNC), une structure analogue à la moelle épinière vertébrée (Figure 1). Il y a environ 50 MNs dans chaque ganglions, qui ciblent les muscles en quatre segments de la jambe homolatérale (coxa, trochanter, fémur et tibia) (Figure 1)3. Ce qui est important, chaque jambe adulte individuel MN a une identité morphologique unique qui est fortement stéréotypée entre animaux3,4. Tous ces MNs uniques proviennent de 11 souches de cellules, appelées neuroblastes (NBs) produisant des jambe MNs durant les stades larvaires3,4. À la fin de l’état larvaire toute la MNs postmitotiques immature différencier durant la métamorphose d’acquérir leurs arbres dendritiques spécifiques et axonales cibles terminales qui définissent leur morphologie unique3,4. Précédemment, nous avons testé l’hypothèse qu’un code combinatoire de facteurs de transcription (TFs) spécifie la morphologie unique de chaque jambe adulte Drosophila MN5. Comme un modèle, nous avons utilisé la lignée B, une des 11 lignées NB qui produit sept sur la MNs et a démontré qu’un code combinatoire de TFs exprimée dans les jambes chez l’adulte postmitotiques MNs dicte leur morphologie individuelle. Par reprogrammation du code TF de MNs, nous avons été en mesure de basculer les morphologies MN d’une manière prévisible. Nous appelons ces TFs : MTF (morphologiques TFs)5.
Une des parties plus difficiles des analyses morphologiques des adultes MNs est de visualiser les axones par une cuticule épaisse et auto-fluorescent à haute résolution. Nous l’étiquette habituellement des axones avec une membrane-tag GFP qui s’exprime en MNs avec un système d’expression binaire, comme DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP ou DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, où DVglut est un puissant moteur exprimé en 6de motoneurones. En combinant ces outils avec d’autres techniques clonales telles que l’analyse de la mosaïque avec un marqueur répressible (MARCM)7, cis-MARCM8ou MARCMbow5, nous pouvons restreindre l’expression de la GFP de sous-populations de MNs, rendant l’analyse phénotypique des axones plus faciles. Nous avons généré un protocole afin de garder la jambe morphologie axonale MN intact pour la reconstruction 3D d’imagerie et suivantes en se penchant sur des questions spécifiques intrinsèques à la jambe de drosophile adulte tels que la fixation de la structure interne de la jambe adulte (1) sans affecter la morphologie de l’axone, expression fluorescente endogène et musculature de la jambe, (2) montage de la jambe pour préserver la structure d’ensemble sous un lamelle couvre-objet et dans l’orientation appropriée pour le traitement afin d’obtenir la cuticule de l’image d’imagerie et (3) fond comme signal fluorescent axonale. Alors que ce protocole a été détaillé pour la détection d’expression fluorescente dans les axones de MN, il peut être appliqué pour visualiser les autres composantes de la neuromusculature de la jambe chez les arthropodes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cuticule de drosophile adulte et des autres arthropodes, qui contient de nombreux pigments sombres, constitue un obstacle majeur pour la visualisation des structures à l’intérieur de leur corps. En outre, il est fortement fluorescent auto qui est aggravée par la fixation. Ces deux caractéristiques sont très problématiques pour les observations des colorants fluorescents ou des molécules à l’intérieur de l’organisme des animaux avec un exosquelette.
La procédure que nous avon…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Robert Renard pour préparer le milieu alimentaire mouche. Ce travail a été soutenu par une subvention de NIH NS070644 à R.S.M. et financement de l’ALS Association (#256), le FRM (#AJE20170537445) et le programme ATIP-Avenir à J.E.
Materials
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100×85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22×22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
Referências
- Miller, A., Demerec, M. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. , 420-531 (1950).
- Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons. Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).
- Enriquez, J., Mann, R. S. Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).
- Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila. Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map. PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).
