Здесь мы представляем экспериментальный протокол, который может использоваться для определения привязки сродства и режим взаимодействия лейбл бесплатно фосфолипидов связывающий белок annexin A2 с иммобилизованными твердой поддержке бислоев (БВУ), одновременно измеряя массового поглощения и вязкоупругие свойства белка annexin A2.
Диссипативных кварцевый микровзвешивания техника представляет собой простой и бесплатный этикетки подход к измерить одновременно массового поглощения и вязкоупругие свойства массы всасывается иммобилизованных на поверхности сенсора, позволяя измерений взаимодействия белков с поддерживаемых твердых поверхностей, таких как липидных бислоев, в режиме реального времени и с высокой чувствительностью. Аннексины являются весьма сохраненных группой фосфолипидов связывающих белков, которые обратимо взаимодействовать с отрицательно заряженных headgroups через координацию ионов кальция. Здесь мы описываем протокол, который был нанят для количественного анализа привязку annexin A2 (AnxA2) на Вселенский липидных бислоев подготовлен на поверхности кварцевых датчика. Этот протокол оптимизирован для получения надежных и воспроизводимых данных и включает в себя подробное пошаговое описание. Этот метод может применяться к другим мембраны связывающих белков и бислой композиции.
Клеточные мембраны являются высоко динамичных и сложных структур. Составные смеси липидов мембран, вместе с периферически или органически связанного мембранных белков, собрать в форме microdomains. Скоординированного темп пространственной организации эти мембраны microdomains участвует в основных физиологических процессов1. Мембрана microdomain динамика движет взаимодействие мембранных липидов, а также способности периферийных мембранных белков признать и взаимодействовать с липидами, обогащенный microdomains. Набор белков для конкретных липидов является часто достигается через липидов признание модулей, таких как pleckstrin гомологии (PH) или C2 домены2,3. Биофизические аналитических методов, с помощью модели мембраны являются ключом к пониманию основных принципов, регулирующих этих процессов на молекулярном уровне.
Аннексины, большой multigene семьи, хорошо известны за их способности связать к отрицательно порученному мембранных липидов, преимущественно фосфатидилсерина (PS), в Ca2 +-контролируется способом2. Второй отличительной чертой annexin семьи является присутствие сохраняется структурная сегмента, annexin повторить, то есть настоящий четыре или восемь раз и гаваней Ca2 +– и фосфолипидов привязки сайтов4. Ca2 +-зависимых липидов взаимодействия помещает Аннексины в идеальном положении, чтобы ощутить и передать Ca2 +-опосредованной сигнализации для целевой мембраны. Последовательно Аннексины способны вызвать образование microdomains, обогащенный холестерина, фосфатидилинозитол-4,5-Бисфосфат (2P PI (4,5)) и PS, оба в сотовой или искусственные мембраны систем5. Этот протокол описывает подход для анализа взаимодействия annexin мембраны, с помощью7,6,кварцевый микровзвешивания диссипация (QCM-D)8.
Основным компонентом в этом микровзвешивания является осциллируя кристалл, который служит в качестве поверхности датчика. Адсорбция или связывания молекул на поверхности датчика снижает частоту резонанса (f) пропорциональное увеличение массы. Если поверхность равномерно покрытые пленкой, привязки дополнительных веществ может мешать структурной целостности этого слоя, и дополнительно может контролироваться такие изменения в вязкоупругости (энергии тангенса D). Это широко методика для изучения взаимодействия белков с липидных бислоев. В этом подходе липидов везикулы поглощаются на поверхность соответствующим покрытием датчика. Липидного бислоя формирование благоприятных материалов на основе силики9,10, как пузырьки часто не разорваться на других поверхностях гидрофильных, таких, как золото11 окисленные после воздействия УФ озона, TiO212или Аль 2O313. Разрыву коалесцирующего везикулы выпускает водяной участок, приводит к характерным изменениям в массы и диссипации. Поколение поддерживает твердых бислоев (БВУ), сплавливание vesicle является простой и надежной и может быть использован для создания сложных моделей, которые имитируют клеточных мембран.
Диссипативных кварцевый микровзвешивания является свободной этикетки и чувствительной техники. Основным преимуществом является возможность покрыть любой материал, который генерирует достаточно тонкой пленки на поверхности, обеспечивая широкий спектр применения в различных научно-исследовательских областях. Взаимодействия протеина мембраны наблюдается в режиме реального времени, и результаты могут быть проанализрованы непосредственно. Одной и той же поверхности датчика может использоваться в последующих измерениях (после выполнения минимальная очистка как описано в настоящем протоколе), таким образом позволяя для точных механизмов внутреннего контроля и сопоставимости между аналитов.
Для ответа на вопросы, касающиеся связи структура функции клеточных мембран и на основе количественных и качественных прибыли биологии клетки больш от использования биофизических подходов на основе устоявшихся и широко используются методы , включая атомной силовой микроскопии (АСМ), поверхностного плазмон резонанс (СРП), и метод QCM-D работающих здесь. Мы показали в предыдущих исследованиях, которые annexin белки связывают в Ca2 +-зависимым образом иммобилизованных мембраны с высоким сродством. Мы используем частоты и диссипации смены из 7-й обертон (Δf7) потому, что это представляет собой наилучший компромисс обнаружения чувствительность и осцилляции стабильности.
Этот метод также позволяет количественное описание взаимодействия мембраны белка. AnxA2 привязки к мембране характеризуется позитивным кооперативность, что при посредничестве annexin основного домена и зависит от наличия холестерина. Количественные данные, полученные для AnxA2 и AnxA8 сообщается в других местах подробно6,8.
Существует много важных шагов в этом протоколе. Использовать липосомы немедленно; в противном случае небольшие пузырьки могут предохранитель в большие пузырьки с меньше поверхностное натяжение, приводит к ингибированию формирования липидного бислоя. Поддерживать постоянную температуру во время измерения. Каждое небольшое отклонение температуры приводит к не незначительной сдвиг частоты и диссипации. Избегайте пузырьков воздуха; в противном случае система неустойчива и не будет установить базовые показатели.
Уравнение Соэрбри позволяет прямое преобразование наблюдаемая частота изменения изменений в массы и, следовательно, широко используется. Однако предположение о линейной корреляции между изменением частоты резонанса и увеличения массы только справедливо для компонентов, образуя жесткую и единообразных пленку на поверхности датчика. Соэрбри уравнение не может использоваться для адсорбентов вязкоупругих таких вод богатые белком фильмов, липидные слои включены водой, или даже адсорбированные клетки. Здесь требуются более сложные математические модели. Таким образом чрезвычайно важно одновременно контролировать изменения в частоте и диссипации. Для выявления структурных изменений во время измерения, могут быть отображены ΔD против Δf коэффициенты, с прямой линии, указывающие не конформационные изменения.
Основным преимуществом этого метода является возможность использовать весьма широкий спектр материалов в качестве субстратов. Кроме того это надежный и прямой способ изучить широкий спектр макромолекулярных взаимодействий, как надлежащее формирование пленок нанесения покрытий (например, SLB), а также дальнейшего взаимодействия белково липидные, может контролироваться онлайн.
Этот протокол может быть применен в других взаимодействующих мембранных белков, например, Бар домен белков19, ERM (Эзрин, radixin и moesin) белка семьи, которая имеет важную роль в Цитоскелет мембраны связь20,21 ,22, или белки, содержащие C2 или PH доменов. Кроме того широкий спектр применения этой методики изучения биологических материалов был успешно опубликован, таким образом устанавливая QCM как хорошо подходит экспериментальной платформы для изучения взаимодействия более сложных макромолекулярных сборок или даже клетки2423,.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft под грантов SFB 858/B04, EXC 1003, SFB 1348/A04 и SFB 1348/A11.
Chemicals | |||
Calciumchloride | Merck | 017-013-00-2 | 99% |
Chloroform | Roth | 4432.1 | 99% |
DOPC | Avanti | 850375P | |
EGTA | PanReac AppliChem | A0878 | 99% |
HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
Methanol | PanReac AppliChem | A3493 | |
PiP2 | Avanti | 850155P | |
POPC | Avanti | 850457P | |
POPS | Avanti | 840034P | |
Sodiumchloride | PanReac AppliChem | A1149 | |
SDS | Roth | 183 | |
Trisodium citrate | PanReac AppliChem | A3901 | |
Equipment | |||
Extruder Liposofast | Avestin | ||
Qsense E4 Analyzer | Qsense | ||
QSense Dfind | Qsense | ||
Pump IPC 4 | Ismatec | ISM 930 | |
QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm | Qsense | QSX 303 | |
PC Membranes 0.05μm | Avanti polar lipids | 610003 | |
OriginPro | OriginLab Corporation | Version 8 and 9 |