在这里, 我们提出了一个实验协议, 可用于确定结合亲和力和模式的相互作用, 无标签磷脂结合蛋白 a2 与固定化固体支持的双层 (slb) 同时测量蛋白质附件 a2 的质量吸收和粘弹性特性。
耗散石英晶体微平衡技术是一种简单而无标签的方法, 可同时测量传感器表面固定质量的质量吸收和粘弹性特性, 从而可以测量相互作用具有固体支撑表面的蛋白质, 如脂质双层, 实时且灵敏度高。附件是一组高度保守的磷脂结合蛋白,通过钙离子的协调与带负电荷的头群发生可逆相互作用。在这里, 我们描述了一个协议, 用于定量分析在石英传感器表面制备的亚氧化亚素 a2 (anxa2) 与平面脂质双层的结合。该协议经过优化, 可获得可靠且可重现的数据, 并包括详细的分步说明。该方法可应用于其他膜结合蛋白和双层组成。
细胞膜是高度动态和复杂的结构。膜脂质的复合混合物, 与外周和/或整体相关的膜蛋白, 聚集在一起形成微域。这些膜微域的协调时空组织参与了关键的生理过程1。膜微域动力学是由膜脂质的相互作用以及外周膜蛋白识别微域中丰富的脂质并与之相互作用的能力驱动的。蛋白质的招募到特定的脂质往往是通过脂质识别模块, 如 plecstrin 同源 (ph) 或 c2 域 2,3。使用模型膜的生物物理分析方法是了解在分子水平上指导这些过程的基本原则的关键。
附件是一个大型多基因家族, 以其在 ca2 +控制的方式中与带负电荷的膜脂质 (主要是磷脂酰丝氨酸 (ps)–结合而闻名.附件家族的第二个特点是存在一个保守的结构段, 即附件重复, 即存在四到八次, 并窝藏 ca2 +-和磷脂结合位点4。ca2 +依赖脂质相互作用使环素处于一个完美的位置, 可以感知和传递 ca2 +介导的信号到目标膜。在细胞和/或人工膜系统5中, 环氧素始终能够诱导富含胆固醇、磷脂酰亚胺醇-4-5-双磷酸 (PI(4,5)P2) 和 ps 的微域的形成.该协议描述了一种利用石英晶体微平衡耗散 (qcm-d)6、7、8分析环素膜相互作用的方法。
这种微平衡中的基本组件是作为传感器表面的振荡晶体。分子对传感器表面的吸附和结合降低了共振频率 (f) 与质量增加成比例。如果表面均匀地涂上薄膜, 附加物质的结合可能会干扰该层的结构完整性, 并且可以另外监测粘弹性 (耗能系数 d) 的这种变化。这是一种研究蛋白质与脂质双层相互作用的广泛技术。在这种方法中, 脂质囊被吸收到适当涂层的传感器表面。脂质双层形成有利于硅基材料9,10, 因为囊泡通常不会在其他亲水表面破裂, 如在紫外线-臭氧接触后氧化的金11 、tio212或al2o313.结泡的破裂释放水相, 导致质量和耗散的特征变化。通过囊泡融合生成固体支持的双层 (slb), 简单而坚固, 可用于生成模拟细胞膜的复杂模型。
耗散石英晶体微平衡是一种无标签、灵敏的技术。一个主要的优势是可以将产生足够薄膜的任何材料涂在表面, 从而在不同的研究领域提供广泛的应用。实时观察了蛋白质与膜的相互作用, 并能直接对结果进行分析。相同的传感器表面可用于后续测量 (在执行本协议中所述的最小清洁后), 从而实现精确的内部控制和分析物之间的可比性。
为了以定量和定性的方式回答有关细胞膜结构-功能关系的问题, 细胞生物学从使用基于成熟和广泛使用的技术的生物物理方法中获益匪浅, 包括原子力显微镜 (afm)、表面等离子体共振 (spr) 和这里使用的 qcm-d 技术。我们在以前的研究中表明, 环素蛋白以 ca2 +依赖的方式与具有高亲和力的固定化膜结合。我们使用第7个言外音 (f7) 的频率和耗散变化, 因为这代表了检测灵敏度和振荡稳定性的最佳妥协。
这种技术还允许定量描述膜-蛋白质相互作用。anxa2 结合膜的特点是正协同作用, 由保守的环素核心域介导, 并取决于胆固醇的存在。在其他地方详细报告了 anxa2 和 AnxA2 的定量数据。
此协议中有许多关键步骤。立即使用脂质体;否则, 小囊泡可能会融合成较大的囊泡, 表面张力较小, 从而抑制脂质双层的形成。在测量过程中保持恒定的温度。温度的每一个微小偏差都会导致不可忽略的频率和耗散变化。避免气泡;否则, 系统是不稳定的, 不会建立基线。
sauerbrey 方程允许将观测到的频率变化直接转换为质量变化, 因此被广泛使用。然而, 共振频率的变化与增加的质量之间的线性相关性的假设只适用于在传感器表面形成刚性和均匀膜的组件。sauerbrey 方程不能用于粘弹性吸附剂, 如富含水的蛋白质膜、含有水的脂质层, 甚至不能用于吸附细胞。在这里, 需要更复杂的数学模型。因此, 同时监测频率和耗散的变化是极其重要的。为了检测测量过程中的结构变化, 可以绘制d 与f 比率, 一条直线表示没有构象变化。
这种技术的一个主要优点是可以使用非常广泛的材料作为基材。此外, 它是研究广泛的大分子相互作用的可靠和直接的方法, 因为表面涂层膜 (如 slb) 的适当形成, 以及进一步的蛋白质-脂质相互作用, 可以在网上监测。
该协议可应用于其他膜相互作用的蛋白质, 例如 bar 域蛋白19、erm (ezrin、radixin 和 moesin) 蛋白家族, 它们在膜细胞骨架连接20、21 中具有重要作用 、22或含有 c2 或 ph 域的蛋白质。此外, 该技术在生物材料研究中的广泛应用也已成功出版, 从而建立了 qcm 作为一个适合的实验平台, 用于研究更复杂的大分子组件甚至更复杂的高分子组件的相互作用。细胞23,24。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了德国堡的支持, 得到了 sfb 858/b04、exc 1003、sfb 1348/a04 和 sfb 1348/A04 的赠款。
Chemicals | |||
Calciumchloride | Merck | 017-013-00-2 | 99% |
Chloroform | Roth | 4432.1 | 99% |
DOPC | Avanti | 850375P | |
EGTA | PanReac AppliChem | A0878 | 99% |
HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
Methanol | PanReac AppliChem | A3493 | |
PiP2 | Avanti | 850155P | |
POPC | Avanti | 850457P | |
POPS | Avanti | 840034P | |
Sodiumchloride | PanReac AppliChem | A1149 | |
SDS | Roth | 183 | |
Trisodium citrate | PanReac AppliChem | A3901 | |
Equipment | |||
Extruder Liposofast | Avestin | ||
Qsense E4 Analyzer | Qsense | ||
QSense Dfind | Qsense | ||
Pump IPC 4 | Ismatec | ISM 930 | |
QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm | Qsense | QSX 303 | |
PC Membranes 0.05μm | Avanti polar lipids | 610003 | |
OriginPro | OriginLab Corporation | Version 8 and 9 |