כאן, אנו מציגים טיפול נסיוני זה יכול להיות מועסק כדי לקבוע את הזיקות מחייב ואת מצב של האינטראקציה של פוספוליפיד מחייב חלבון ללא תווית annexin A2 עם קיבוע הנתמכות על-ידי מוצק bilayers (סאט גלובל) על ידי מדידת בו זמנית ספיגת המוני, המאפיינים viscoelastic של החלבון annexin A2.
הטכניקה microbalance dissipative גביש הקוורץ הינה גישה פשוטה ונטולת תווית למדוד בו זמנית את המאפיינים ספיגת ו- viscoelastic המוני של מסה נספג/ותשמרו על משטחים חיישן, המאפשר את המידות של האינטראקציה החלבונים משטחים הנתמכות על-ידי מוצק, כגון bilayers השומנים, בזמן אמת, עם רגישות גבוהה. Annexins הם קבוצה מאוד ההכפלה של פוספוליפיד מחייב חלבונים המקיימים אינטראקציה הפיכה עם headgroups טעונים שלילית דרך התיאום של יונים של סידן. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול הועסק לנתח באופן כמותי את הכריכה של annexin A2 (AnxA2) את השומנים מישורי bilayers שהוכנו על פני השטח של חיישן קוורץ. פרוטוקול זה ממוטבת כדי לקבל נתונים לשחזור ועמיד, כולל תיאור מפורט שלב אחר שלב. השיטה ניתן ליישם מחייב קרום חלבונים ויצירות bilayer אחרים.
ממברנות הסלולר הן דינמיות ומורכבות מאוד מבנים. תערובת מורכבת של שומנים ממברנה, יחד עם ממברנה באופן עקיף ו/או ומקווים המשויך חלבונים, להרכיב את טופס microdomains. תהליכים פיזיולוגיים מפתח1מעורב ארגון מרחבי טמפו מתואמת של אלה microdomains ממברנה. קרום microdomain dynamics מונעים על-ידי הגומלין של קרום שומנים, וכן על ידי היכולת של חלבוני ממברנה פריפריאלי לזהות ולקיים אינטראקציה עם שומנים מועשר microdomains. הגיוס של חלבונים ליפידים ספציפי לעתים קרובות מושגת באמצעות זיהוי השומנים מודולים, כגון הומולוגיה של pleckstrin (PH) או C2 תחומים2,3. שיטות אנליטיות biophysical באמצעות מודל ממברנות הם המפתח להבנת העקרונות הבסיסיים המסדירים את התהליכים האלה ברמה המולקולרית.
Annexins, multigene-משפחה גדולה, ידועים ביכולתם לאגד ממברנה טעונים שלילית שומנים, בעיקר phosphatidylserine (PS), ב- Ca2 +-נשלט באופן2. סימן ההיכר השני של משפחת annexin היא הנוכחות של מקטע מבניים שנשמרת, annexin. חוזר, כלומר נוכח ארבעה או שמונה פעמים בנמלים Ca2 +– ו אתרי פוספוליפיד מחייב4. Ca2 +-השומנים תלויים באינטראקציה ממקם את annexins בעמדה מצוינת כדי לחוש ומשדרות Ca2 +-מתווכת איתות לממברנות היעד. באופן עקבי, annexins מסוגלים לגרום להיווצרות microdomains מועשר ב כולסטרול, phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate (PI (4.5) P2) ו- PS, הן מערכות ממברנות הסלולר ו/או מלאכותי5. פרוטוקול זה מתאר גישה זו כדי לנתח את האינטראקציה annexin-ממברנה בעזרת גביש הקוורץ Microbalance פיזור (QCM-D)6,7,8.
המרכיב הבסיסי ב microbalance הזה הוא קריסטל נדנוד משמש המשטח חיישן. ספיחה ו/או איגוד של מולקולות על פני השטח חיישן של הקטנת תהודה תדירות (נ) פרופורציונליים להעלייה במסה. אם פני השטח באופן שווה מצופה סרט, הכריכה של חומרים נוספים עלולים להפריע השלמות. המבנית של שכבה זו, שינויים ב- viscoelasticity (אנרגיה פיזור הגורם D) ניתן לנטר בנוסף. זוהי טכניקה נפוצה את האינטראקציה של חלבונים עם השומנים bilayers. בגישה זו, השומנים שלפוחית נספגים על גבי המשטח חיישן מצופה בהתאם. היווצרות ליפיד bilayer היא חיובית על חומרים מבוססי-סיליקה9,10, כמו שלפוחית לעיתים קרובות לא להיקרע על משטחים הידרופילית אחרים, כגון זהב11 מחומצן לאחר חשיפה UV-אוזון, TiO212או Al 2O313. שבר השלפוחיות המוגלתיות התגבשו משחרר שלב מימית, מובילים לשינויים האופייניים מסה והוללות. הדור של הנתמך על-ידי מוצק bilayers (סאט גלובל) מאת בועית פיוז’ן חזקה ופשוט והוא יכול לשמש כדי ליצור דגמים מורכבים המחקים ממברנות הסלולר.
גביש קוורץ dissipative microbalance היא טכניקה ללא תווית ורגיש. היתרון העיקרי הוא האפשרות לקבל מעיל חומר שיוצר סרט דק במידה מספקת על גבי המשטח, ובכך לספק מגוון רחב של יישומים בתחומים מגוונים מחקר. האינטראקציה חלבון-הממברנה הוא ציין בזמן אמת, ולא ניתן לנתח את התוצאות ישירות. השטח חיישן אותו יכול לשמש במדידות עוקבות (לאחר ביצוע ניקוי מינימלי כפי שמתואר פרוטוקול זה), ובכך מאפשר בקרה פנימית מדויקת, של comparability בין analytes.
כדי לענות על שאלות לגבי היחס מבנה פונקציה של ממברנות הסלולר הן באופן כמותיים ואיכותניים, תא הרווחים ביולוגיה לאין שיעור משימוש של גישות biophysical בהתבסס על ומבוססת, בשימוש נרחב בטכניקות , כולל אטומי לכפות מיקרוסקופ (AFM), משטח פלזמון תהודה (SPR), והעסיק הטכניקה QCM-D כאן. הראנו במחקרים קודמים חלבונים annexin לאגד ב Ca2 +-תלוי באופן למוח קיבוע עם זיקה גבוהה. אנו משתמשים בתדר, פיזור משמרות של 7 צליל עילי (Δf7) כי זה מייצג את הפשרה הטובה ביותר של זיהוי רגישות, תנודה יציבות.
טכניקה זו מאפשרת גם תיאור כמותי של אינטראקציה חלבון ממברנלי. AnxA2 מחייב הקרום מאופיינת cooperativity חיובי זה מתווך על ידי קבוצת המחשבים ליבת annexin שנשמרת ותלוי הנוכחות של כולסטרול. הנתונים הכמותיים שהושג עבור AnxA2 ו- AnxA8 הם דיווחו פירוט במקום6,8.
ישנם שלבים קריטיים רבים פרוטוקול זה. להשתמש ליפוזומים באופן מיידי; אחרת, שלפוחית קטנה אולי הפתיל לתוך שלפוחית גדול יותר עם פחות מתח, שמוביל עיכוב של היווצרות bilayer השומנים. לשמור על טמפרטורת חום קבועה במהלך המדידות. בכל בסטיות הקטנות בטמפרטורה יוצרת שינוי תדירות והוללות לא זניח. להימנע בועות אוויר; אחרת, המערכת יציב והם לא יקימו תוכנית בסיסית.
המשוואה Sauerbrey מאפשרת המרה ישירה של התדר שנצפה שינוי שינויים במסה, ולכן, בשימוש נרחב. ההנחה של מתאם ליניארי בין שינוי תדר תהודה המסה נוספה רק מחזיקה נכון עבור רכיבי ויוצרים סרט נוקשה ובלתי אחיד על פני השטח חיישן. המשוואה Sauerbrey אינם יכולים לשמש עבור viscoelastic adsorbents כגון מים עתירי חלבון סרטים, שכבות השומנים במים מואגד, או אפילו הספוחה תאים. . הנה, מודלים מתמטיים מורכבים יותר נדרשים. לכן, חשוב מאוד לעקוב בו-זמנית אחר השינויים בתדירות והוללות. כדי לזהות שינויים מבניים במהלך המדידה, ΔD לעומת Δf יחסי ניתן להתוות, עם קו ישר המציין אין שינויים הסתגלותי.
היתרון העיקרי של טכניקה זו היא האפשרות לשימוש במגוון רחב מאוד של חומרים דיאלקטריים. יתר על כן, זה שיטה אמינה וישירה ללמוד מגוון רחב של אינטראקציות macromolecular, כמו היווצרות נאותה של הסרטים ציפוי פני השטח (כגון סאט גלובל), כמו גם אינטראקציות חלבון-השומנים נוספות, ניתן לנטר באופן מקוון.
פרוטוקול זה יכול להיות מוחל על חלבונים אחרים ממברנה-אינטראקציה, לדוגמה, בר תחום חלבונים19, ERM (אזרין, radixin ו moesin) חלבון המשפחה בעלת תפקיד חשוב בממברנה-שלד התא הצמדה20,21 ,22, או חלבונים המכילים דומיינים C2 או PH. יתר על כן, מגוון רחב של יישומים של טכניקה זו ללמוד חומרים ביולוגיים בהצלחה שפורסם, ובכך לבסס QCM כפלטפורמה ניסיוני ולסדרם ללמוד את האינטראקציות מכלולים מורכבים יותר macromolecular או אפילו תאים23,24.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי פתוח תחת מענקים SFB 858/B04, סיפורה ה 1003, SFB 1348/A04, SFB 1348/A11.
Chemicals | |||
Calciumchloride | Merck | 017-013-00-2 | 99% |
Chloroform | Roth | 4432.1 | 99% |
DOPC | Avanti | 850375P | |
EGTA | PanReac AppliChem | A0878 | 99% |
HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
Methanol | PanReac AppliChem | A3493 | |
PiP2 | Avanti | 850155P | |
POPC | Avanti | 850457P | |
POPS | Avanti | 840034P | |
Sodiumchloride | PanReac AppliChem | A1149 | |
SDS | Roth | 183 | |
Trisodium citrate | PanReac AppliChem | A3901 | |
Equipment | |||
Extruder Liposofast | Avestin | ||
Qsense E4 Analyzer | Qsense | ||
QSense Dfind | Qsense | ||
Pump IPC 4 | Ismatec | ISM 930 | |
QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm | Qsense | QSX 303 | |
PC Membranes 0.05μm | Avanti polar lipids | 610003 | |
OriginPro | OriginLab Corporation | Version 8 and 9 |