Summary

Die Nutzung von Maus Splenocyten, Pathogen-assoziierte molekulare Muster Einfluss auf die Genexpression Uhr abzuschätzen

Published: July 24, 2018
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, mit der Maus splenocyten, um Pathogen-assoziierte molekulare Muster zu entdecken, die molekulare Uhr Genexpression verändern.

Abstract

Vom Verhalten, Genexpression regulieren ZIRKADIANE Rhythmen fast alle Aspekte der Physiologie. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Maus splenocyten mit der Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) Lipopolysaccharid (LPS), ODN1826 und Hitze getötet Listeria Monocytogenes hinterfragen und prüfen ihre Wirkung auf die molekularen zirkadianen Uhr. Bisher haben Studien untersuchen den Einfluss von LPS auf der molekularen Uhr mit einer Vielzahl von in Vivo und ex Vivo Ansätze aus einem Sortiment von Modellen (z. B. Maus, Ratte und Mensch) fokussiert. Dieses Protokoll beschreibt die Isolation und die Herausforderung des splenocyten sowie die Methodik zur Uhr Gen Ausdruck nach Herausforderung über quantitative PCR zu beurteilen. Dieser Ansatz lässt sich nicht nur der Einfluss der mikrobielle Komponenten auf der molekularen Uhr aber auch andere Moleküle zu bewerten, die Ausdruck der Uhr ändern kann. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um die molekularen Mechanismen wie PAMP-Toll-Like-Rezeptor-Interaktion beeinflusst Uhr Ausdruck auseinander zu necken.

Introduction

Der master-Clock bei Säugetieren, der 24 h Schwingungen für fast alle Aspekte der Physiologie und Verhalten orchestriert, liegt in den suprachiasmatischen Kern (SCN) des Hypothalamus1,2. Neben der Regulierung der biologischen Prozesse auf organismal Ebene, synchronisiert der master-Clock auch periphere zelluläre Uhren im gesamten Körper3,4,5. Während der molekularen Uhr Maschinen aus mindestens drei ineinandergreifenden transkriptionelle translationale Feedback-Schleifen besteht, besteht der Kern der Periode (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1, und Uhr Gene6,7. Neben der Pflege des genaue Timing der molekularen Uhr Kern, einige ergänzende Uhr Genprodukte (z. B. Rev-Erbα und Dbp) regulieren auch Ausdruck des nicht-uhrengene, d. h. Uhr kontrollierten Gene (KVG)6 , 7.

Funktionelle Molekulare Uhren wurden in verschiedenen immun Gewebe (z. B. Milz und Lymphknoten)8 und Zellen (z. B. B Zellen, Dendritische Zellen, Makrophagen)8,9beschrieben. Diese Zellen erkennen und reagieren auf Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs), konservierte mikrobielle Komponenten über angeborene immune Anerkennung Rezeptoren wie Toll-Like-Rezeptoren (TLR)10. Bisher wurden 13 funktionale TLRs beschrieben, erkennen die mikrobielle Bestandteile wie bakterielle Zellwand-Komponenten, flagellar Protein und mikrobielle Nukleinsäuren10. PAMP, Lipopolysaccharid (LPS), eine Zellwand-Komponente von Gram-negativen Bakterien erkannt von TLR4, nachweislich zirkadianen Rhythmen auf organismal und molekularer Ebene zu verändern. Z. B. in Vivo Herausforderung der LPS induzierte photic-ähnliche Phase Verzögerungen Aktivität in Mäusen11 gemessen und führte zu reduzierten Uhr gen-Expression in der SCN und Leber in Situ Hybridisierung und quantitative PCR bestimmt, bzw. in Ratten12. Nach einer in-Vivo -Herausforderung mit LPS ergab die Analyse der menschlichen peripheren Blut Leukozyten13 und subkutanem Fettgewebe14 veränderte Expression von mehreren uhrengene gemessen über qPCR. Zu guter Letzt geändert ex Vivo LPS Herausforderungen des menschlichen Makrophagen und Maus peritonealen Makrophagen, führte auch zu Uhr Ausdruck qPCR14gemessen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um den Einfluss der PAMPs LPS, ODN1826 (synthetische Oligonukleotide mit unmethylated CpG Motive), zu bewerten und Hitze getötet Listeria Monocytogenes (HKLM), anerkannt von TLR4, TLR9 und TLR2, bzw. auf Molekulare Uhr Genexpression in Maus splenocyten. Das Protokoll enthält Maus Splenektomie, Splenocyte Isolierung und Herausforderung, RNA Extraktion, cDNA Synthese und qPCR Ausdruck mehrere uhrengene bewerten. Dieses Protokoll ermöglicht für den rechtzeitigen Erwerb einer großen Anzahl von Immunzellen mit sehr kleinen Tier oder zellulären Manipulation, die dann ex Vivo mit verschiedenen PAMPs in Frage gestellt. Die molekulare Uhr hat gezeigt, dass verschiedene Aspekte der Immunantwort8,15,16modulieren, Störung der molekularen Uhr beeinträchtigt daher höchstwahrscheinlich die richtige zeitabhängige Variation von der Immunantwort. Darüber hinaus da Störungen des zirkadianen Rhythmen zu schweren Pathologien17,18,19,20führen können, kann es von Interesse für Forscher, splenocyten mit einer breiten Palette von Herausforderung sein Moleküle und deren Einfluss auf die Uhr zu beurteilen.

Protocol

Während der Studie Tierpflege und Behandlung National Institutes of Health Policy eingehalten, wurden in Übereinstimmung mit Richtlinien und wurden von der University of Hartford institutionelle Animal Tierpflege und Use Committee genehmigt. (1) die Mitnahme von Tieren Hinweis: Zwanzig Wochen alten männlichen B6129SF2/J Mäusen werden in der Studie verwendet. Mitzureißen Mäuse auf ein 12 h Licht (standard Overhead weißes Licht) / 12 h Dunkel-Zyklus f…

Representative Results

Mäuse wurden geopfert, bei ZT13, splenocyten wurden isoliert und ex Vivo mit den PAMPs LPS, ODN1826 oder HKLM in Frage gestellt. Nach 3 h RNA wurde isoliert und qPCR wurde verwendet, um relative Ausdruck Niveaus der molekularen uhrengene zu beurteilen, die Uhr, Per2, Dbp, und Rev-Erbα im Vergleich zu unangefochten Kontrollzellen. Nach PAMP Herausforderung waren Uhr Ausdruck Niveaus nicht wesentlich anders als Ausdruck in der Kontroll…

Discussion

Innerhalb dieses Protokolls kann ein Microvolume Spektralphotometer zur Quantifizierung und Beurteilung der Reinheit der verwendeten bei der Bestimmung der Genexpression RNA verwendet werden. Nukleinsäuren absorbieren UV-Licht bei 260 nm, Proteine in der Regel absorbieren Licht bei 280 nm, während andere potentielle Schadstoffe verwendet, während ein RNA-Extraktionsverfahren (z. B. Phenol) nachweisbar bei 230 sind nm. Daher, durch die Beurteilung der Extinktion (A) Verhältnis bei 260/280 nm (RNA zum Protein)…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Fakultät Forschung aus der College of Arts and Sciences Dean Büro an der University of Hartford gewährt.

Materials

Frosted slides Fisher 12-550-343
Cell strainers Fisher 22363547
Lipopolysaccharide  InvivoGen ltrl-eklps
ODN1826 InvivoGen Tlrl-1826-1
HKLM InvivoGen Tlrl-hklm
RPMI 1640 Gibco 11875-093
PBS Gibco 20012-043
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 or 74106
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254
6-well cell culture plate Denville T1006
50 ml tubes Corning 352070
15 ml tubes Corning 352097
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit ThermoFisher 4368814
TaqMan Gene Expression Assays b-actin ThermoFisher Mm00607939_s1
TaqMan Gene Expression Assays Per2 ThermoFisher Mm00478113_m1
TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba ThermoFisher Mm00520708_m1
TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 ThermoFisher Mm00500226_m1
TaqMan Gene Expression Assays Dbp ThermoFisher Mm00497539_m1
qPCR machine StepOnePlus ThermoFisher
TaqMan Gene Expression Master Mix ThermoFisher 4369016
MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml) ThermoFisher 4346907
Statistical Analysis Software Prism 7.0a

Referências

  1. Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
  2. Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
  3. Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
  4. Yoo, S. -. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
  5. Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
  6. Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
  7. Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O’Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
  8. Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
  9. Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
  10. Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
  11. Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
  12. Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
  13. Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
  14. Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
  15. Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
  16. Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
  17. Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
  18. Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
  19. Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
  20. Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
  21. . Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , (2018).
  22. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
  23. Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
  24. Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579 (2018).

Play Video

Citar este artigo
Silver, A. C. The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression. J. Vis. Exp. (137), e58022, doi:10.3791/58022 (2018).

View Video