L’utilisation des splénocytes de souris afin d’évaluer les micro-organismes pathogènes associés un motif moléculaire Influence sur l’Expression génique horloge

L’horloge maître chez les mammifères, qui orchestre les oscillations de 24h pour presque tous les aspects de la physiologie et le comportement, est situé dans le noyau suprachiasmatic (SCN) de l’hypothalamus^1,2. En plus de réglementer les processus biologiques au niveau organismique, l’horloge maître synchronise également les périphériques horloges cellulaires dans tout le corps^3,4,5. Alors que le mécanisme de l’horloge moléculaire est constitué d’au moins trois boucles de rétroaction transcriptionnel traductionnel imbriquées, le noyau est composé de la période (PAR1-3), les cryptochromes (Cry1-2), les Bmal1, et horloge gènes^6,7. Outre le maintien du moment précis de l’horloge moléculaire de base, certains produits de gène horloge auxiliaires (p. ex., Rev-erbα et Dbp) aussi régulent l’expression de gènes non-horloge, horloge soit contrôlé gènes (NGCC)^{6 , 7}.

Les horloges moléculaires fonctionnels ont été décrites dans les différents tissus immunitaires (p. ex., la rate et des ganglions lymphatiques)⁸ et cellules (par exemple, B cellules, cellules dendritiques, macrophages)^8,9. Ces cellules détecter et réagir aux micro-organismes pathogènes associés profils moléculaires (PAMPs), composants microbiens conservées, via des récepteurs de reconnaissance immunitaire innée comme les récepteurs Toll-like (TLRs)¹⁰. A ce jour, 13 TLR fonctionnelles ont été décrits, qui reconnaissent les constituants microbiens tels que les composants de la paroi cellulaire bactérienne, flagellaire protéines et acides nucléiques microbienne¹⁰. Le PAMP, lipopolysaccharide (LPS), un composant de la paroi cellulaire des bactéries à Gram négatif reconnu par TLR4, s’est avéré altérer les rythmes circadiens aux niveaux moléculaires et organismiques. Par exemple, en vivo défi de LPS induit par les retards de phase de type photique telle que mesurée par l’activité souris¹¹ et conduit à horloge réduit l’expression des gènes dans le SCN et le foie, tel que déterminé par hybridation in situ et PCR quantitative, respectivement, chez les rats¹². Après un défi en vivo avec LPS, analyse de sang périphérique humain leucocytes¹³ et du tissu adipeux sous-cutané¹⁴ ont révélé une expression altérée de plusieurs gènes de l’horloge tel que mesuré par l’intermédiaire de qPCR. Enfin, ex vivo défis LPS des macrophages humains et macrophages péritonéaux de souris, a également conduits à altération de l’expression de l’horloge tel que mesuré par qPCR¹⁴.

Nous décrivons ici un protocole pour évaluer l’influence du LPS PAMPs, ODN1826 (oligonucléotides synthétiques contenant unmethylated motifs CpG) et tués par la chaleur Listeria monocytogenes (HKLM), reconnu par le TLR4 et TLR9 TLR2, respectivement, sur expression du gène horloge moléculaire en splénocytes de souris. Le protocole inclut une splénectomie souris, isolement de splénocytes et défi, RNA extraction, synthèse de cDNA et qPCR afin d’évaluer l’expression de plusieurs gènes de l’horloge. Ce protocole permet l’acquisition rapide d’un grand nombre de cellules immunitaires avec très peu d’animaux ou manipulation cellulaire, qui peut ensuite être contestée ex vivo avec PAMPs différents. L’horloge moléculaire a été montré pour moduler les divers aspects de la réponse immunitaire^8,15,16, donc, dérèglement de l’horloge moléculaire nuirait très probablement la bonne variation dépendant du temps de la réponse immunitaire. En outre, étant donné que les perturbations des rythmes circadiens peuvent conduire à des pathologies graves^17,18,19,20, il peut être d’intérêt pour les chercheurs de contester les splénocytes avec un large éventail de molécules et d’évaluer leur influence sur l’horloge.