Использование мыши Splenocytes оценить патоген связанные молекулярные модели влияние на экспрессию генов будильник
Summary
Этот протокол описывает метод, с помощью мыши splenocytes обнаружить патоген связанные молекулярные модели, которые изменить выражение гена молекулярные часы.
Abstract
От поведения для экспрессии генов циркадные ритмы регулируют почти все аспекты физиологии. Здесь мы представляем методологии вызов splenocytes мыши с патоген связанные молекулярные структуры (PAMPs) липополисахарида (LPS), ODN1826 и жар убитые листерий и изучить их воздействие на молекулярном суточного Часы. Ранее исследования были посвящены изучению влияния LPS на молекулярные часы, с использованием различных подходов в естественных условиях и ex vivo из ассортимента моделей (например, мышь, крысы и человека). Этот протокол описывает изоляции и вызов splenocytes, а также методологии оценки после задача выражение гена часы через количественного PCR. Этот подход может использоваться для оценки не только влияние микробиологических компонентов на молекулярные часы но других молекул, которые могут изменить выражение часов. Этот подход может использоваться помимо дразнить молекулярный механизм влияния будильник выражение PAMP-Толл подобный рецептор взаимодействия.
Introduction
Главные часы в млекопитающих, который оркеструет 24 h колебаний для почти всех аспектах физиологии и поведения, расположен в пределах Супрахиазмальное ядро (SCN) гипоталамус1,2. Помимо регулирования биологических процессов на Организменное уровне, мастер будильник синхронизирует периферийных сотовой часы на протяжении всего тела3,4,5. В то время как молекулярные часы машины состоит из по меньшей мере три взаимосвязанных transcriptional поступательные обратной, ядро состоит из периода (Per1-3), Криптохром (Cry1-2), Bmal1, и часы генов6,7. Помимо поддержания точного времени основные молекулярные часы, некоторые продукты гена вспомогательные будильник (например, Rev-erbα и Dbp) также регулировать экспрессию генов-часы, то есть, часы контролируемых генов (CCGs)6 , 7.
Функциональные молекулярные часы были описаны в различных иммунных тканей (например, селезенке и лимфатических узлах)8 и клетки (например, B клетки, дендритные клетки, макрофаги)8,9. Эти клетки обнаруживать и реагировать патоген связанные молекулярные структуры (PAMPs), сохраняется микробные компоненты, через врожденное иммунного распознавания рецепторов Толл подобные рецепторы (TLRs)10. На сегодняшний день, были описаны 13 функциональных TLRs, которые признают микробной составляющих, таких как компоненты клеточной стенки бактерий, flagellar белка и микробных нуклеиновые кислоты10. Было показано, что PAMP, липополисахарида (LPS), компонент клеточной стенки грамположительных бактерий, признанные TLR4, изменить циркадные ритмы на научные и молекулярном уровнях. Например в естественных условиях задача ЛПС индуцированной фотическом как этап задержки как измеряется активность мышей11 и привело к сокращению Будильник экспрессии генов в ППП и печени определяется в situ Гибридизация и количественного PCR, соответственно в12крыс. После вызов в vivo с ПЛАСТИНОК анализ лейкоцитов периферической крови человека13 и подкожной жировой клетчатки14 показал изменены экспрессию нескольких генов Будильник, измеренного через ПЦР. И наконец ex vivo LPS проблемы человеческого макрофагов и мыши перитонеальных макрофагов, также привело к экспрессию часы как измеряется ПЦР14.
Здесь мы описываем протокол для оценки влияния PAMPs LPS, ODN1826 (синтетические олигонуклеотиды содержащих unmethylated CpG мотивы) и жар убитые листерий (HKLM), TLR4, TLR9 и TLR2, соответственно, на молекулярные часы экспрессии генов в splenocytes мыши. Протокол включает в себя мыши спленэктомии, splenocyte изоляции и вызов, РНК добыча, синтез cDNA и ПЦР Оценить экспрессию нескольких генов будильник. Этот протокол обеспечивает своевременное приобретение большого числа иммунных клеток с очень мало животных или сотовый манипуляции, которые затем могут быть оспорены ex vivo с различными PAMPs. Было показано, что молекулярные часы модулировать различные аспекты иммунного ответа8,,1516, таким образом, нарушение молекулярных часов скорее всего подорвет надлежащее время зависимых вариации иммунный ответ. Кроме того поскольку нарушения циркадианных ритмов может привести к серьезной патологии17,18,19,20, может быть интерес для исследователей, чтобы оспорить splenocytes с широкий спектр молекулы и оценить их влияние на часах.
Protocol
Representative Results
Discussion
В рамках этого протокола спектрофотометр microvolume может использоваться для количественного определения и оценки чистоты используется в определении экспрессии генов РНК. Нуклеиновые кислоты поглощают УФ света на 260 Нм, белки обычно поглощают свет в 280 Нм, в то время как другие потенциальн…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана факультет исследовательских грантов от Колледж искусств и наук Дин отделении университета Хартфорда.
Materials
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | |
| 15 ml tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
Referências
- Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
- Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Yoo, S. -. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
- Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O’Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
- Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
- Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
- Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
- Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
- Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
- Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
- Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
- Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
- Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
- Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
- Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
- Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
- . Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , (2018).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
- Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
- Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579 (2018).
