Summary

Polisoma Profiling nel testicolo di topo, cellule umane e di Leishmania

Published: April 08, 2018
doi:

Summary

L’obiettivo generale di tecnica di profilatura polisoma è analisi di attività traduzionale di singoli mRNA o del trascrittoma mRNA durante la sintesi proteica. Il metodo è importante per gli studi di regolamento di sintesi della proteina, l’attivazione di traduzione e repressione in salute e più malattie umane.

Abstract

Espressione della proteina corretta al momento giusto e nelle giuste quantità è alla base della funzione normale delle cellule e la sopravvivenza in un ambiente veloce-cambiante. Per lungo tempo, gli studi di espressione genica sono stati dominati dalla ricerca al livello trascrizionale. Tuttavia, i livelli allo stato stazionario di mRNA non correlano bene con la produzione di proteine, e la traducibilità dei mRNAs varia notevolmente a seconda delle condizioni. In alcuni organismi, come il parassita Leishmania, l’espressione della proteina è regolata principalmente a livello traduzionale. Studi recenti hanno dimostrato che dysregulation di traduzione della proteina è associata con cancro, metabolico, neurodegenerative e altre malattie umane. Polisoma profiling è un metodo potente per studiare il regolamento della proteina di traduzione. Permette di misurare lo stato traduzionale di singoli mRNA o esaminare la traduzione su scala genomica. La base di questa tecnica è la separazione di polisomi, ribosomi, loro subunità e mRNAs gratuito durante la centrifugazione di un pattern citoplasmatico lisato attraverso un gradiente di saccarosio. Qui, presentiamo un protocollo profilatura polisoma universale utilizzato su tre diversi modelli – parassita maggiore di Leishmania, cellule umane coltivate e tessuti animali. Leishmania cellule crescono liberamente in sospensione e cellule umane coltivate crescono nello strato monomolecolare aderente, mentre testicolo di topo rappresenta un campione di tessuto animale. Così, la tecnica si adatta a tutte queste fonti. Il protocollo per l’analisi delle frazioni polisomici include rilevamento dei singoli livelli di mRNA di RT-qPCR, proteine mediante Western blot e analisi di RNA ribosomiale (rRNA) tramite l’elettroforesi. Il metodo può essere ulteriormente esteso da esame dell’associazione di mRNA con il ribosoma a livello del trascrittoma di profonda RNA-seq e analisi delle proteine associate ribosoma di spettroscopia di massa delle frazioni. Il metodo può essere facilmente regolato ad altri modelli biologici.

Introduction

Regolazione dell’espressione genica in cellule è controllata da meccanismi trascrizionali, post-trascrizionale e post-traduzionali. Progressi nel sequenziamento di RNA profondo consentono lo studio dei livelli di mRNA di stazionario su scala genomica a un livello senza precedenti. Tuttavia, recenti scoperte hanno rivelato che il livello di mRNA allo steady-state non correla sempre con proteina produzione1,2. Il destino di una trascrizione individuale è molto complesso e dipende da molti fattori come stress, stimoli interni/esterni, ecc. Regolazione dell’espressione genica durante la sintesi delle proteine fornisce un ulteriore livello di controllo necessario per una risposta rapida in condizioni di cambiamento di espressione. Profili, la separazione e la visualizzazione di tradurre attivamente ribosomi, polisoma (o “polyribosome”) è un metodo efficace per studiare la regolazione della sintesi proteica. Anche se le prime applicazioni sperimentali è apparso in the 1960s3, polisoma profilatura è attualmente una delle tecniche più importanti nella proteina traduzione studi4. Singolo mRNA può essere tradotto da più di un ribosoma che portano alla formazione di un polisoma. Le trascrizioni possono essere bloccate sui ribosomi con cicloesimmide5 e mRNA contenente diversi numeri di polisomi possa essere separati nel processo di frazionamento polisoma da saccarosio ultracentrifugazione di pendenza6,7 , 8 , 9. analisi di RNA delle frazioni polisomici quindi permette la misura dei cambiamenti negli Stati traduzionali di singoli mRNA su scala genomica e durante diverse condizioni fisiologiche4,7, 10. il metodo è stato utilizzato anche per rivelare i ruoli di 5′ UTR e 3′ UTR sequenze nel controllo di mRNA traducibilità11, esaminare il ruolo dei miRNA nella repressione traduzionale12, difetti nella biogenesi dei ribosomi13 e comprendere il ruolo delle proteine associate ribosoma con malattie umane14,15. Durante l’ultimo decennio, un ruolo sempre più importante per la regolazione dell’espressione genica durante la traduzione è emerso che illustra la sua importanza nelle malattie umane. La prova per controllo traduzionale in cancro, metabolico e malattie neurodegenerative è schiacciante15,16,17,18. Ad esempio, disregolazione del controllo traduzionale eIF4E-dipendente contribuisce all’autismo relativi deficit15 e FMRP è coinvolto in stallo dei ribosomi su mRNA legati all’autismo14. Così, profili polisomici è uno strumento molto importante per studiare i difetti nella regolazione traduzionale in malattie umane multiple.

Analisi della proteina di polisomici frazioni in differenti condizioni fisiologiche analizza la funzione dei fattori connessi con i ribosomi durante la traduzione. La tecnica di profilatura polisoma è stata utilizzata in molte specie tra cui il lievito, le cellule di mammiferi, piante e protozoi10,19,20,21. Protozoi parassiti come Trypanosoma e Leishmania esibiscono limitato controllo trascrizionale dell’espressione genica. Loro genomi sono organizzati in cluster di geni coregolati polycistronic che la mancanza di trascrizione promotore-regolato22. Invece, espressione genica inerente allo sviluppo è controllato principalmente al livello della proteina traduzione e stabilità del mRNA in Trypanosomatidae specie23,24. Di conseguenza, la comprensione del controllo traduzionale in assenza di regolazione trascrizionale è particolarmente importante per questi organismi. Profilatura polisomici è un potente strumento per studiare la regolazione post-trascrizionale dell’espressione genica in Leishmania25,26,27,28.

I recenti progressi nella rilevazione dei livelli di singoli mRNA dal real tempo quantitative PCR (RT-qPCR) e completo trascrittoma di sequenziamento di nuova generazione, nonché tecnologie di proteomica, offre una risoluzione e vantaggi di profilatura polisomici ad un nuovo livello. L’uso di questi metodi può essere ulteriormente esteso dall’analisi delle singole frazioni polisomici di sequenziamento di RNA profondo combinato con analisi proteomica per monitorare lo stato traduzionale delle cellule su una scala di genoma. Ciò permette l’individuazione di nuovi giocatori molecolari che regolano la traduzione sotto differenti condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo un polisoma universale protocollo utilizzato su tre diversi modelli di analisi: il parassita maggiore di Leishmania, cellule umane coltivate e tessuti animali. Vi presentiamo consigli sulla preparazione dei lisati cellulari da organismi differenti, ottimizzazione delle condizioni di gradiente, scelta di inibitori della RNAsi e applicazione di RT-qPCR, Western blot ed elettroforesi del RNA per analizzare le frazioni polisoma in questo studio.

Protocol

Tutti i trattamenti degli animali e la gestione dei tessuti ottenuti nello studio sono state eseguite secondo protocolli approvati dal comitato di utilizzo presso la Texas Tech University Health Science Center secondo il National Institutes of e istituzionali Animal Care Salute benessere animale linee guida, numero di protocollo 96005. Si prega di sacrificare animali vertebrati e preparare tessuti secondo le linee guida del Comitato di uso e istituzionali Animal Care. Se in mancanza di tale comitato, consultare le linee …

Representative Results

In questo studio, descriviamo l’applicazione della tecnica di profilatura polisomici a tre diverse fonti: parassita maggiore di Leishmania, cellule umane coltivate e testicolo di topo. Leishmania cellule crescono liberamente in mezzi liquidi in sospensione, cellule umane coltivate crescono nello strato monomolecolare del aderente su piastre e testicolo del mouse rappresenta un campione di tessuto. Il metodo può essere facilmente regolato a altri tipi di cellule liberame…

Discussion

Frazionamento di polisoma di gradiente di saccarosio combinato con RNA e proteina analisi delle frazioni è un metodo potente per analizzare stato traduzionale di singoli mRNA o l’intero translatome e anche ruoli di fattori proteici regolazione traduzionale macchinari durante il normale stato fisiologico o malattia. Profilatura polisomici è una tecnica particolarmente adatta per studiare la regolazione traduzionale in organismi come trypanosomatids tra cui Leishmania dove controllo trascrizionale è praticament…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano Ching Lee per aiuto con la registrazione audio. La ricerca è stata sostenuta dai fondi di Start-up da Texas Tech University Health Sciences Center e per il centro di eccellenza per neuroscienze traslazionali e Therapeutics (CTNT) concede PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW a A.L.K.; in parte da grant di NIH R01AI099380 K.Z. James C. Huffman e Kristen R. Baca erano studiosi CISER (centro per l’integrazione di staminali formazione & ricerca) e sono stati sostenuti dal programma.

Materials

Instruments:
Gradient master Biocomp Instruments Inc. 108
Piston Gradient Fractionator Biocomp Instruments Inc. 152
Fraction collector Gilson, Inc. FC203B
NanoDrop One Thermo Scientific NanoDrop One
Nikon inverted microscope Nikon ECLIPSE Ts2-FL/Ts2
2720 Thermal Cycler Applied Biosystems by Life Technologies 4359659
CO2 incubator Panasonic Healthcare Co. MCO-170A1CUV
HERATHERM incubator Thermo Scientific 51028063
Biological Safety Cabinet, class II, type A2 NuAire Inc. NU-543-400
Revco freezer Revco Technologies ULT1386-5-D35
Beckman L8-M Ultracentifuge Beckman Coulter L8M-70
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5424
Ultracentrifuge Rotor SW41 Beckman Coulter 331362
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62
Fixed angle rotor Eppendorf F-45-30-11
Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 Applied Biosystems by life technologies 4470661
TC20 Automated cell counter Bio-Rad 145-0102
Hemacytometer Hausser Scientific 02-671-51B
Software 
Triax software  Biocomp Instruments Inc.
Materials:
Counting slides, dual chamber for cell counter Bio-Rad 145-0011
1.5 mL microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) Seton Scientific 7030
Syringe, 5 mL BD 309646
BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle BD 10020439
Nunclon Delta Surface plate, 14 cm Thermo Scientific 168381
Nunclon Delta Surface plate, 9 cm Thermo Scientific 172931
Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES Thermo Scientific 569-0020
BioLite 75 cm3 flasks Thermo Scientific 130193
Nunc 50 mL conical centrifuge tubes Thermo Scientific 339653
Chemicals:
Trizol LS Ambion by Life Technologies 10296028
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Trizma base Sigma T1378-5KG
Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) Sigma D6429-500ML
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F0926-50ML
Penicillin-Streptomycin (P/S) Sigma P0781-100ML
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Sigma D8537-500ML
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) Acros Organics AC413415000
Potassium Chloride (KCl) Sigma P9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40) Fluka (Sigma-Aldrich) 74385
Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Heparin sodium salt Sigma H3993-1MU
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors Roche Diagnostics 11836170001
Glycogen Thermo Scientific R0551
Water Sigma W4502-1L
Cycloheximide Sigma C7698-1G
Chloroform Fisher Scientific 194002
Dithiotreitol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Ethidium Bromide Fisher Scientific BP-1302-10
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) Fisher Scientific S316-212
Optimem Life Technologies 22600050
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833-100MG
Sucrose Fisher Scientific S5-3KG
Trypsin-EDTA solution Sigma T4049-100ML
Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit Applied Biosystems by life technologies 4368814
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems by life technologies 4367659
HCl Fisher Scientific A144SI-212
Isopropanol Fisher Scientific BP26324
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma 221473-500G
Anti-RPL11 antibody Abcam ab79352
Ribosomal protein S6 (C-8) antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-74459
1xM199 Sigma M0393-10X1L
Lithium cloride Sigma L-9650
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128-500
Gel Loading Buffer II Thermo Scientific AM8546G
UltraPure Agarose Thermo Scientific 16500-100
Trichloracetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-100
SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate Thermo Scientific 34580
Formaldehyde Fisher Scientific BP531-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma L5750-1KG
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626-5G
RNeasy Mini kit Qiagen 74104
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma A1852-1VL
Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) Sigma C1506-250MG
Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) Sigma U6625-100MG
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) Sigma G8877-250MG
SP6 RNA Polymerase NEB M0207S
Pyrophoshatase Sigma I1643-500UN
Spermidine Sigma S0266-1G

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Citar este artigo
Karamysheva, Z. N., Tikhonova, E. B., Grozdanov, P. N., Huffman, J. C., Baca, K. R., Karamyshev, A., Denison, R. B., MacDonald, C. C., Zhang, K., Karamyshev, A. L. Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis. J. Vis. Exp. (134), e57600, doi:10.3791/57600 (2018).

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