Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato

Regulação da expressão gênica em células é controlada por mecanismos transcriptional, posttranscriptional e pós-traducional. Avanços no sequenciamento de RNA profundo permitam o estudo dos níveis de mRNA de estado estacionário no genoma escala em um nível sem precedentes. No entanto, descobertas recentes revelaram que nível de mRNA de estado estacionário não sempre se correlaciona com a produção de proteína^1,2. O destino de uma transcrição individual é muito complexo e depende de muitos fatores, como estímulos internos/externos, stress, etc. Regulação da expressão gênica durante a síntese de proteína fornece outra camada de controle de expressão necessária para uma resposta rápida na mudança de condições. Polysome (ou “polyribosome”) de criação de perfil, a separação e visualização de ativamente traduzir ribossomas, é um poderoso método para estudar a regulação da síntese de proteínas. Embora, suas primeiras aplicações experimentais apareceram na década de 1960³, polysome perfil é atualmente uma das técnicas mais importantes na proteína tradução estudos⁴. MRNAs único pode ser traduzidos por mais de um ribossoma, levando à formação de um polysome. As transcrições podem ser paralisadas em ribossomas com cicloheximida⁵ e mRNAs contendo números diferentes de polissomos podem ser separados no processo de fracionamento de polysome por ultracentrifugação gradiente de sacarose^{6,7 , 8 , 9}. análise de RNA de frações polysomal então permite a medição de mudanças nos Estados translacionais de mRNAs individuais no genoma-larga escala e durante diferentes condições fisiológicas^{4,7, 10}. o método também tem sido usado para revelar os papéis de 5′ UTR e 3′ UTR sequências no controle do mRNA Traduzibilidade próprios¹¹, examinar o papel dos miRNAs em repressão traducional¹², descobrir defeitos na biogênese Ribossoma¹³ e compreender o papel das proteínas Ribossoma-associados com doenças humanas^14,15. Durante a última década, um crescente papel para regulação da expressão gênica durante a tradução emergiu que ilustra a sua importância em doenças humanas. A evidência para controle de translação em câncer, metabólica e doenças neurodegenerativas é esmagadora^15,16,17,18. Por exemplo, a desregulação do controle traducional eIF4E-dependente contribui para autismo relacionados com os défices¹⁵ e FMRP está envolvido em empatar de ribossomos na mRNAs ligados ao autismo¹⁴. Assim, polysomal de criação de perfil é uma ferramenta muito importante para estudar os defeitos no Regulamento translacional em várias doenças humanas.

Análise de proteínas de frações polysomal sob diferentes condições fisiológicas disseca a função dos fatores associados a ribossomas durante a tradução. A técnica de polysome de perfil tem sido usada em muitas espécies, incluindo leveduras, células de mamíferos, plantas e protozoários^10,19,20,21. Protozoários parasitas como o Trypanosoma e Leishmania exibem limitado controle transcricional da expressão do gene. Seus genomas são organizadas em clusters de gene policistrônico que falta a transcrição regulada promotor²². Em vez disso, a expressão gênica no desenvolvimento é predominantemente controlada ao nível da tradução de proteínas e estabilidade do mRNA em Trypanosomatidae espécie^23,24. Portanto, a compreensão do controle translacional na ausência de regulamento transcriptional é particularmente importante para estes organismos. Perfil polysomal é uma ferramenta poderosa para estudar posttranscriptional regulação da expressão gênica em Leishmania^25,26,,^27,28.

Os recentes progressos na detecção de níveis de mRNAs individuais pelo real tempo PCR quantitativo (RT-qPCR) e transcriptoma completa por sequenciamento de próxima geração, bem como tecnologias de proteômica, traz a resolução e as vantagens de polysomal perfil a um novo nível. A utilização desses métodos pode ser estendida ainda mais através da análise das frações de polysomal individuais por sequenciamento de RNA profundo combinado com análise proteômica para monitorar o status de translação de células na escala do genoma. Isto permite a identificação de novos jogadores moleculares regulamenta tradução sob diferentes condições fisiológicas e patológicas. Aqui, apresentamos um polysome universal de perfil protocolo usado em três modelos diferentes: o parasita Leishmania major, culturas de células humanas e tecidos animais. Apresentamos o Conselho sobre a preparação de lisados celulares de organismos diferentes, otimização das condições de gradiente, escolha de inibidores de RNase e aplicação de RT-qPCR, Western blot e eletroforese de RNA para analisar frações de polysome neste estudo.