Полисома профилирование лейшманий, клетки человека и мыши яичка
Summary
Общая цель Полисома метод профилирования является анализ поступательной деятельности индивидуальных mRNAs или транскриптом mRNAs во время синтеза белка. Этот метод имеет важное значение для исследования регулировка синтеза протеина, перевод активации и репрессий в области здравоохранения и несколько заболеваний человека.
Abstract
Надлежащего белков в нужное время и в правильном количестве является основой нормальной клеточной функции и выживания в быстро меняющейся среде. Для долгое время исследования выражение гена были преобладаны исследований на уровне транскрипционный анализ. Однако устойчивого состояния уровня мРНК не хорошо коррелируют с производства белка, и переводимости mRNAs варьируется в зависимости от условий. В некоторых организмов, как паразит лейшманийвыражение протеина регулируется главным образом на уровне поступательное. Недавние исследования показали, что белки перевод dysregulation связан с раком, метаболические, нейродегенеративных и других болезней человека. Полисома профилирование является мощный метод для изучения белков перевод правил. Это позволяет измерить поступательного хода индивидуальных mRNAs или проверить перевод в геном масштабе. Основой этой технологии является разделение polysomes, рибосомы, их подразделений и бесплатные mRNAs во время центрифугирования от цитоплазмы lysate через градиент сахарозы. Здесь мы представляем универсальный Полисома профилирования протокол, используемый на трех различных моделей – паразит лейшмании основных, культивируемых клеток человека и животных тканей. Лейшмании клетки свободно растут в суспензии и культивируемых клеток человека растут в адэрентных монослоя, в то время как мыши яичка представляет пример тканей животных. Таким образом метод приспособлен для всех этих источников. Протокол для анализа polysomal фракций включает обнаружение отдельные уровни mRNA по RT-ПЦР, белки западной помарки и анализа рибосомной РНК электрофорезом. Этот метод может быть продлен изучение ассоциации мРНК рибосомы на уровне глубокой РНК seq транскриптом и анализ рибосомы связанных белков, масс-спектроскопии фракций. Метод можно легко регулировать другие биологические модели.
Introduction
Регуляцию экспрессии генов в клетках контролируется транскрипционный анализ, посттранскрипционного и Посттрансляционная механизмами. Достижения в глубоких РНК последовательности позволяют исследования уровни mRNA установившегося в геном масштабе на беспрецедентном уровне. Однако последние результаты показали, что уровень мРНК установившегося не всегда коррелируют с белком производства1,2. Судьба отдельных транскрипт является очень сложным и зависит от многих факторов, как внутренних/внешних раздражителей, стресс и т.д. Регуляцию экспрессии генов во время синтеза белка обеспечивает еще один уровень управления выражений, необходимых для быстрого реагирования в изменяющихся условиях. Полисома (или «polyribosome»), профилирование, разделения и визуализация активно перевода рибосомы, является мощный метод для изучения регуляции синтеза белка. Хотя, его первый экспериментальный приложений появилась в 1960-х3, Полисома профилирование является в настоящее время одним из наиболее важных методов в белок перевод исследования4. Один мРНК могут быть переведены на более чем один рибосомы, приводит к образованию Полисома. Стенограммы может быть тупик на рибосомах с циклогексимида5 и мРНК, содержащих различное количество polysomes могут быть разделены в процессе ректификации Полисома сахарозы градиента ultracentrifugation6,7 , 8 , 9. анализ РНК polysomal фракций затем позволяет измерение изменений в трансляционной государствах индивидуальных mRNAs генома масштабе и в ходе различных физиологических условиях4,7, 10. метод также использовался для раскрыть роль 5′ УТР и 3′ УТР последовательностей в контроле мРНК переводимости11, изучить роль адаптивной трансляционная репрессий12, выявления дефектов в рибосома биогенеза13 и понять роль белков рибосомы связанные с заболеваний человека14,15. В течение последнего десятилетия растущая роль для регуляции экспрессии генов в процессе перевода выяснилось, что свидетельствует о его важности в заболеваниях человека. Свидетельство для трансляционного управления в рак, метаболические и нейродегенеративных заболеваний является подавляющее15,16,,17–18. К примеру, способствует регуляции eIF4E-зависимых трансляционная управления аутизмом связанных с дефицитом15 и FMRP участвует в тупик рибосом на мРНК, связанных с аутизмом14. Таким образом polysomal профилирование является очень важным инструментом для изучения дефекты в трансляционной регулирования в нескольких заболеваний человека.
Анализ протеина polysomal фракций при различных физиологических условиях рассекает функцию факторов, связанных с рибосомами в процессе перевода. Был использован метод профилирования Полисома у многих видов, включая дрожжи, клетки млекопитающих, растения и простейшие10,19,,2021. Протозойные паразитами Trypanosoma и лейшмании выставку ограниченное управление транскрипционный анализ экспрессии генов. Геномы организуются в полицистронная гена кластеры, которые не регулируются промоутер транскрипции22. Вместо этого экспрессии генов развития преимущественно контролируется на уровне перевода протеина и стабильность мРНК в Трипаносоматиды видов23,24. Таким образом понимание трансляционная управления при отсутствии регуляцию особенно важное значение для этих организмов. Polysomal профилирование является мощным инструментом для изучения посттранскрипционного регуляцию экспрессии генов в лейшмании25,26,27,28.
Недавний прогресс в обнаружения индивидуальных mRNAs уровней в режиме реального времени количественного PCR (RT-ПЦР) и полным транскриптом секвенирование нового поколения, а также технологий протеомики, приносит резолюции и преимущества polysomal профилирования на новый уровень. Использование этих методов может быть продлен путем анализа отдельных polysomal фракций, глубокие последовательности РНК, в сочетании с протеомного анализа для мониторинга трансляционная состояния клеток в геном-масштабе. Это позволяет выявлять новых молекулярных игроков, регулирующие перевод различных физиологических и патологических условиях. Здесь мы представляем универсальный Полисома профилирования протокол, используемый на трех различных моделей: паразит лейшмании крупных, культивируемых клеток человека и животных тканей. Мы представляем рекомендации по подготовке lysates клетки из разных организмов, оптимизация условий градиента, выбор РНКазы ингибиторов и применение RT-ПЦР, Западная помарка и электрофорез RNA для анализа Полисома фракции в этом исследовании.
Protocol
Representative Results
Discussion
Фракционирование Полисома градиент сахарозы в сочетании с РНК и белка анализ фракций является мощный метод для анализа трансляционная статус индивидуальных mRNAs или весь translatome, а также роли факторов белков, регулирующих поступательные машины во время нормальной физиологической или б?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Чинг ли за помощь с аудио записи. Исследования было поддержано запуска средства от центра Texas Tech университета медицинских наук и в центр передового опыта для Поступательное неврологии и терапии (CTNT) предоставить PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; в части гранта NIH R01AI099380 К.Ж Джеймс C. Хаффмана и Кристен р. Baca были CISER (центр по интеграции стволовых образование и исследования) ученых и были поддержаны программой.
Materials
| Instruments: | ||
| Gradient master | Biocomp Instruments Inc. | 108 |
| Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments Inc. | 152 |
| Fraction collector | Gilson, Inc. | FC203B |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | NanoDrop One |
| Nikon inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2-FL/Ts2 |
| 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems by Life Technologies | 4359659 |
| CO2 incubator | Panasonic Healthcare Co. | MCO-170A1CUV |
| HERATHERM incubator | Thermo Scientific | 51028063 |
| Biological Safety Cabinet, class II, type A2 | NuAire Inc. | NU-543-400 |
| Revco freezer | Revco Technologies | ULT1386-5-D35 |
| Beckman L8-M Ultracentifuge | Beckman Coulter | L8M-70 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-45-30-11 |
| Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 | Applied Biosystems by life technologies | 4470661 |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0102 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-51B |
| Software | ||
| Triax software | Biocomp Instruments Inc. | |
| Materials: | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 145-0011 |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 |
| Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) | Seton Scientific | 7030 |
| Syringe, 5 mL | BD | 309646 |
| BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle | BD | 10020439 |
| Nunclon Delta Surface plate, 14 cm | Thermo Scientific | 168381 |
| Nunclon Delta Surface plate, 9 cm | Thermo Scientific | 172931 |
| Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES | Thermo Scientific | 569-0020 |
| BioLite 75 cm3 flasks | Thermo Scientific | 130193 |
| Nunc 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339653 |
| Chemicals: | ||
| Trizol LS | Ambion by Life Technologies | 10296028 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 |
| Trizma base | Sigma | T1378-5KG |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) | Sigma | D6429-500ML |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-50ML |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma | P0781-100ML |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma | D8537-500ML |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) | Acros Organics | AC413415000 |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma | P9541-500G |
| Nonidet P 40 (NP-40) | Fluka (Sigma-Aldrich) | 74385 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3993-1MU |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors | Roche Diagnostics | 11836170001 |
| Glycogen | Thermo Scientific | R0551 |
| Water | Sigma | W4502-1L |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-1G |
| Chloroform | Fisher Scientific | 194002 |
| Dithiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 |
| Ethidium Bromide | Fisher Scientific | BP-1302-10 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) | Fisher Scientific | S316-212 |
| Optimem | Life Technologies | 22600050 |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833-100MG |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3KG |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049-100ML |
| Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Applied Biosystems by life technologies | 4368814 |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | 4367659 |
| HCl | Fisher Scientific | A144SI-212 |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26324 |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma | 221473-500G |
| Anti-RPL11 antibody | Abcam | ab79352 |
| Ribosomal protein S6 (C-8) antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-74459 |
| 1xM199 | Sigma | M0393-10X1L |
| Lithium cloride | Sigma | L-9650 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 |
| Gel Loading Buffer II | Thermo Scientific | AM8546G |
| UltraPure Agarose | Thermo Scientific | 16500-100 |
| Trichloracetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-100 |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34580 |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L5750-1KG |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626-5G |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A1852-1VL |
| Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) | Sigma | C1506-250MG |
| Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) | Sigma | U6625-100MG |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma | G8877-250MG |
| SP6 RNA Polymerase | NEB | M0207S |
| Pyrophoshatase | Sigma | I1643-500UN |
| Spermidine | Sigma | S0266-1G |
Referências
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).
- Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
- Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
- Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
- Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).
- Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
- Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5′ UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
- Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
- Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
- Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
- Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).
- De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. Gene expression regulation in trypanosomatids. Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).
- Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
- De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
- Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
- McNicoll, F., et al. Distinct 3 ‘-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
- Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 ‘-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
- Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (1989).
- Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
- Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
