Generación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales
Summary
Este artículo proporciona un protocolo detallado para la preparación y evaluación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales para su uso en inmunoensayos diferentes. Este procedimiento incluye vacunación, fusión celular, indirecta ELISA competitivo para clon positiva proyección y preparación de hibridomas monoclonal. También se proporcionan las especificaciones para la caracterización de anticuerpos mediante MALDI-TOF-MS y los análisis de ELISA.
Abstract
El análisis de los componentes bioactivos presentes en los alimentos y productos naturales se ha convertido en una popular zona de estudio en muchos campos, incluyendo tradicional China medicina y alimentos seguridad/Toxicología. Muchas de las técnicas de análisis clásicas requieren equipo costoso o conocimientos. En particular, análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) se han convertido en un método emergente para el análisis de alimentos y productos naturales. Este método se basa en la detección de anticuerpo-mediada de los componentes de destino. Sin embargo, como muchos de los componentes bioactivos en productos naturales son pequeños (< 1.000 Da) y no se debe inducir una respuesta inmune, creación de anticuerpos monoclonales (mAbs) contra ellos es a menudo difícil. En este protocolo, brindamos una explicación detallada de los pasos necesarios para generar mAbs contra moléculas Diana así como los necesarios para crear los asociados indirectos competitiva (ic) ELISA para el análisis rápido del compuesto en muestras múltiples. El procedimiento describe la síntesis del antígeno artificial (es decir, el conjugado hapteno-carrier), inmunización, fusión celular, preparación de hibridomas monoclonal, caracterización de la mAb y la aplicación basada en ELISA del mAb. El conjugado hapteno-carrier fue sintetizado por el sodio periodato método y evaluado por MALDI-TOF-MS. Después de la inmunización, esplenocitos fueron aislados de ratón inmunizado con el más alto título del anticuerpo y se fundió con la hipoxantina-aminopterina-timidina (sombrero) – línea de celular de mieloma de ratón sensible Sp2/0 – Ag14 con un polietilenglicol (PEG)-método basado en. Los hibridomas secretoras de mAbs reactivo para el antígeno de la blanco fueron defendidos por icELISA de especificidad y reactividad cruzada. Además, se aplicó el método de dilución limitante para preparar monoclonales hibridomas. Los mAbs finales se caracteriza por icELISA y entonces utilizados en una aplicación de ELISA para la detección rápida y conveniente de hapteno ejemplo (naringina (NAR)) en productos naturales.
Introduction
Anticuerpos monoclonales (mAbs), también conocido como mono específicos anticuerpos, producidos a partir de un solo clon de linfocitos b y se componen de anticuerpos monovalentes que se unen al mismo epitopo1. En los últimos años, muchos productos naturales derivados de plantas medicinales se han utilizado en el tratamiento de diversas enfermedades2. De hecho, muchos compuestos moleculares pequeños originalmente derivados de productos naturales se aplican ahora como medicamentos de primera línea, como la artemisinina contra la malaria y paciltaxel (taxol) para cáncer2,3. El estudio de productos naturales ha hecho progreso rápido, en gran parte debido al enorme desarrollo y optimización de técnicas convencionales de análisis, como cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y espectrometría de masas (MS). Sin embargo, todavía existen algunas limitaciones asociadas con estos métodos, como sus protocolos de tratamiento complejos y costes asociados en tiempo, mano de obra/experiencia y requiere instrumentos4.
Recientemente, se han aplicado análisis de mAb-basado enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) cualitativa y cuantitativamente analizar alimentos y productos naturales. De hecho, este método se ha aplicado para el análisis de muestras biológicas y pruebas clínicas y se ha demostrado para ser precisos, sensibles y altamente eficiente, también evitando los tediosos pasos pretratamiento asociados con otros análisis5, 6.
Cuando se utiliza a Elisa mAb-basado para el estudio de productos naturales complejos, preparación de los anticuerpos monoclonales es uno de los pasos fundamentales. Por desgracia, los mAbs específicos de los pequeños componentes bioactivos presentes en estos tipos de sustancias6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 a menudo son limitados en comparación con los antígenos de la proteína. Para evitar este problema, hemos desarrollado un protocolo para generar específicamente mAbs contra pequeños compuestos. El protocolo que presentamos incluye síntesis antígeno artificial, inmunización del ratón, fusión celular, ELISA competitiva indirecto y preparación de hibridomas monoclonal.
En particular, nuestro grupo de investigación ha sido estudiar la formación de mAbs contra pequeños compuestos bioactivos de la medicina tradicional China y sus aplicaciones durante años. En nuestros estudios en curso, hemos desarrollado mAbs contra Baicalina16, puerarin17, ácido glicirrícico18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121y muchas otras moléculas pequeñas. Nuestros protocolos de ELISA basadas en estos mAbs se han utilizado en varios estudios para evaluar la farmacocinética de estas pequeñas moléculas, así como sus interacciones con otros compuestos bioactivos. Por otra parte, utilizando estos mAbs, también hemos desarrollado métodos de cromatografía de inmunoafinidad para la separación de análogos estructurales, incluidos los epímeros. Recientemente, hemos preparado un inmunoensayo de flujo lateral utilizando nuestro mAb anti-puerarin que posteriormente fue utilizado para la detección rápida, en el sitio de este compuesto. Nuestros resultados indican que nuestros ensayos de mAb son herramientas indispensables y convenientes para el estudio de la biología y la calidad de los compuestos derivados de productos naturales, particularmente los utilizados en la medicina tradicional China.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, presentamos un protocolo para la producción exitosa de mAbs contra moléculas pequeñas derivadas de productos naturales. Los pasos esenciales en el procedimiento han sido descritos, y hemos demostrado la utilidad de este protocolo utilizando NAR como una molécula pequeña de ejemplo. Los espectros de ejemplo, análisis de reactividad y icELISA resultados muestran representante experimental y datos de control que se obtuvieron mediante este protocolo. Imágenes de ejemplo de los hibridomas proporcionan una repre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (números de concesión 81573573, 81473338 y 81503344) y la clásica receta básica equipo de investigación en la Universidad de Beijing de Medicina China.
Materials
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
Referências
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