Geração de anticorpos monoclonais contra produtos naturais
Summary
Este artigo fornece um protocolo detalhado para a preparação e avaliação de anticorpos monoclonais contra produtos naturais para uso em diversos imunoensaios. Esse procedimento inclui imunização, fusão celular, indirecto ELISA competitivo para clone positivo triagem e preparação de hibridoma monoclonal. As especificações para a caracterização de anticorpo usando análises de ELISA e MALDI-TOF-MS também são fornecidas.
Abstract
A análise dos componentes bioativos presentes em alimentos e produtos naturais tornou-se uma popular área de estudo em muitos campos, incluindo o tradicional chinesa medicina e comida segurança/toxicologia. Muitas das técnicas de análise clássica exigem equipamentos caros e/ou experiência. Notavelmente, ensaios imunoenzimático (ELISA) tornaram-se um método emergente de análise de alimentos e produtos naturais. Este método baseia-se na mediada por anticorpo de detecção de componentes o alvo. No entanto, como muitos dos componentes bioativos em produtos naturais são pequenos (< 1.000 Da) e não provocar uma resposta imune, criar anticorpos monoclonais (mAbs) contra eles, muitas vezes é difícil. Neste protocolo, nós fornecemos uma explicação detalhada das etapas necessárias para gerar mAbs contra moléculas-alvo, bem como aqueles necessários para criar o associado indireta competitiva (ic) ELISA para a análise rápida do composto em várias amostras. O procedimento descreve a síntese do antígeno artificial (ou seja, o conjugado de hapteno-portador), imunização, fusão celular, preparação de hibridoma monoclonal, caracterização do mAb e o aplicativo baseado em ELISA do mAb. O conjugado de hapteno-transportadora foi sintetizado por sódio periodato método e avaliada por MALDI-TOF-MS. Após a imunização, splenocytes foram isoladas a partir do rato imunizado com o mais alto título de anticorpos e fundido com a hipoxantina-aminopterin-timidina (HAT) – linha celular do mouse sensível mieloma Sp2/0 – Ag14 usando um polietileno glicol (PEG)-com base em método. As hibridomas secretando mAbs reativo ao antígeno alvo foram projectadas pelo icELISA de especificidade e de reactividade cruzada. Além disso, o método de diluição limitante foi aplicado para preparar os hybridomas monoclonais. Os finais mAbs foram ainda mais caracterizadas por icELISA e então utilizados em um aplicativo baseado em ELISA para a detecção rápida e conveniente de hapteno o exemplo (naringinases (NAR)) em produtos naturais.
Introduction
Anticorpos monoclonais (mAbs), também conhecido como anticorpos mono-específicos, são produzidos a partir de um único clone de linfócitos e são compostos de anticorpos monovalentes, que só ligam para o mesmo epítopo1. Nos últimos anos, utilizaram-se muitos produtos naturais de origem vegetal medicinais no tratamento de várias doenças2. De fato, muitos compostos moleculares pequenos originalmente derivados de produtos naturais são agora aplicados como drogas de primeira linha, tais como artemisinina para malária e paciltaxel (taxol) para câncer2,3. O estudo de produtos naturais tem feito progressos rápidos, em grande parte devido a enorme desenvolvimento e otimização de técnicas de análise convencionais, incluindo cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e espectrometria de massa (MS). No entanto, ainda existem algumas limitações associadas com esses métodos, tais como seus protocolos complexos de pré-tratamento e custos associados com relação ao tempo, mão de obra/expertise e instrumentos necessários4.
Recentemente, aplicaram-se ensaios baseados em mAb imunoenzimático (ELISA) para qualitativa e quantitativamente análise de alimentos e produtos naturais. Na verdade, esse método tem sido aplicado para análise de amostras biológicas e testes clínicos e foi mostrado para ser exato, sensível e altamente eficiente, evitando também as etapas de pré-tratamento tediosas associadas com outras análises5, 6.
Quando usando Elisa mAb-baseado para estudar produtos naturais complexos, preparação dos anticorpos monoclonais é uma das principais etapas. Infelizmente, os mAbs específicos aos pequenos componentes bioativos presentes nestes tipos de substâncias6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 muitas vezes são limitados em comparação com os antígenos da proteína. Para contornar esse problema, temos desenvolvido um protocolo para gerar especificamente mAbs contra pequenos compostos. O protocolo aqui apresentado inclui a síntese artificial de antígeno, imunização de rato, fusão celular, ELISA competitiva indireta e preparação de hibridoma monoclonal.
Notadamente, nosso grupo de pesquisa foi estudar a formação de mAbs contra pequenos compostos bioativos de medicinas chinesas tradicionais e desenvolver suas aplicações há anos. Em nossos estudos em curso, desenvolvemos mAbs contra baicalin16, puerarina17, de ácido glicirrízico18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121e muitas outras pequenas moléculas. Nossos protocolos de ELISA baseados nesses mAbs têm sido utilizados em uma série de estudos para avaliar a farmacocinética destas pequenas moléculas, bem como suas interações com outros compostos bioativos. Além disso, usando esses mAbs, também desenvolvemos immunoaffinity métodos de cromatografia para separação de análogos estruturais, incluindo epimers. Recentemente, preparamos um imunoensaio de fluxo lateral usando nosso mAb antipuerarina que foi posteriormente usado para detecção rápida no local deste composto. Nossos resultados indicam que nossos ensaios mAb-based são ferramentas indispensáveis e convenientes para estudar a biologia e a qualidade de compostos naturais-produto-derivado, particularmente aqueles usados em medicinas chinesas tradicionais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, apresentamos um protocolo para a produção bem sucedida de mAbs contra naturais produto derivado pequenas moléculas. As etapas essenciais no procedimento foram delineadas, e temos demonstrado a utilidade do presente protocolo usando NAR como uma pequena molécula de exemplo. Os espectros de exemplo, análises de reatividade e icELISA resultados que todos mostram representante experimental e dados de controle que são obtidos usando este protocolo. Imagens de exemplo das hibridomas fornecem uma representação vis…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (concessão números 81573573, 81473338 e 81503344) e a clássica receita básica equipe de pesquisa da Universidade de Beijing de medicina chinesa.
Materials
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
Referências
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