Detección altamente sensible y cuantitativa de las proteínas y sus isoformas por método capilar isoeléctrica
Summary
Isoeléctrica capilar es una técnica basada en anticuerpos, ultrasensible, alto rendimiento, permitiendo la caracterización detallada de las proteínas y sus isoformas de muestras biológicas muy pequeñas. A continuación describe un protocolo para la detección y cuantificación de proteínas específicas y sus isoformas de manera automatizada y robotizada.
Abstract
Immunoblotting se ha convertido en una técnica de rutina en muchos laboratorios para la caracterización de proteínas de muestras biológicas. El siguiente protocolo provee una estrategia alternativa, capilar isoeléctrico centrado (cIEF), con muchas ventajas en comparación con el convencional immunoblotting. Se trata de un método basados en anticuerpos, automatizado, rápido y cuantitativo en que efectúe un procedimiento completo de Blot western dentro de un tubo capilar ultrafino. Esta técnica no requiere un gel para transferencia a una membrana, de borrones, ni películas, que son normalmente necesarias para immunoblotting convencional de rayos x. Aquí, las proteínas se separan según su carga (punto isoeléctrico, pI), usando menos un microlitro (400 nL) de lisado de proteínas total. Después de la electroforesis, las proteínas están inmovilizadas en las paredes capilares por tratamiento con luz ultravioleta, seguido por primaria y secundaria (peroxidasa de rábano (HRP) conjugada) incubación de anticuerpos, cuyo enlace se detecta con mayor quimioluminiscencia (ECL), generando una señal luminosa que puede ser capturada y registrada por una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD). La imagen digital puede ser analizada y cuantificada (área de pico) utilizando el software. Este procedimiento de alto rendimiento puede manejar 96 muestras a la vez; es muy sensible, con la detección de proteínas en el rango del picogramo; y produce resultados altamente reproducibles debido a la automatización. Todos estos aspectos son extremadamente valiosos cuando la cantidad de muestras (por ejemplo, las muestras de tejido y biopsias) es un factor limitante. La técnica tiene usos más amplios, incluyendo la investigación de fármacos o anticuerpos, descubrimiento de biomarker y propósitos de diagnóstico.
Introduction
Capilar la concentración isoeléctrica (cIEF) es un inmunoanálisis automatizado, basado en el tubo capilar que resuelve proteínas sobre la base de su carga1,2,3. Es altamente reproducible y capaz de resolver las proteínas y sus isoformas postraduccional modificado rápida y cuantitativamente. Presenta una alternativa a los métodos convencionales como el western blot. Mientras que el western blot es muy bueno para confirmar la presencia de abundantes proteínas en muestras de fácil acceso; variabilidad, consumo de tiempo y precisa cuantificación de todos los presentes desafíos, en particular al examinar muestras de tejidos biológicos. De hecho, la variabilidad es un problema inherente en el borrar occidental, ya que existen numerosos pasos involucrados, tales como carga y funcionamiento de los geles de SDS-PAGE, transferencia de proteínas sobre la membrana, incubación con diversos reactivos (por ej., primaria y secundaria anticuerpos, ECL) y el desarrollo en la película de rayos x4. En la actualidad, la técnica western blot está mejorando con la aplicación de grabación digital de señales quimioluminiscente (Western digital). Recientemente, un sistema automatizado de western blot se ha desarrollado, es decir, el tubo capilar occidental, que es un sistema más libre de las manos y libre de gel. El ensayo completo está automatizado después de la carga de una placa de la muestra (muestras con todos los reactivos necesarios) en el sistema3,4. El instrumento llevará a cabo todos los pasos como la separación de las proteínas, inmovilización de proteínas en la pared capilar, incubaciones de anticuerpo, lava entre diferentes pasos y el desarrollo y cuantificación de la señal quimioluminiscente. Así, el procedimiento de cIEF presentado aquí ofrece mayor resolución y sensibilidad.
Este método es sensible, como las señales pueden ser generadas y cuantificadas de picogramos de proteínas1. La alta sensibilidad con una reproducibilidad excelente hace esta tecnología muy útil para el análisis de muestras clínicas. Puede detectar como distinguir post traslacional modificación (por ejemplo, proteína fosforilada diferentes isoformas) de proteínas. Esta tecnología se ha utilizado con éxito para diseccionar diferentes señalización vías4,5 en estudios clínicos con el objetivo de desarrollar nuevas terapias en cáncer3, y tiene gran potencial para el descubrimiento de biomarcadores y de la droga de proteína .
Protocol
Representative Results
Discussion
Sensibilidad y la resolución de las proteínas son cruciales para la investigación proteómica en muestras biológicas. Hay gran valor en ser capaz de detectar proteínas que están presentes en cantidades diminutas en las células. cIEF puede ofrecer mejoras en la sensibilidad y resolución para la detección de proteínas y sus isoformas4.
Esta tecnología se ha utilizado con éxito en muchos proteómicos investigación informes5,<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El autor agradece a Prof. Lena Claesson-Galés, Universidad de Uppsala, Suecia por su apoyo para el desarrollo de este proyecto. Además, el autor agradece a Ross Smith y Lena Claesson-Galés, Universidad de Uppsala para su lectura crítica y sugerencias para mejorar el manuscrito.
Materials
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
Referências
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