毛细管电聚焦法对蛋白质及其亚型的高灵敏度和定量检测
Summary
毛细管等电聚焦是一种基于抗体的、超灵敏的高通量技术, 它能够从极小的生物样品中详细描述蛋白质及其亚型。下面介绍了一种自动和机器人的方法, 用于检测和量化特定蛋白质及其亚型。
Abstract
免疫印迹法已成为许多实验室的常规技术, 用于从生物样品中进行蛋白质的表征。下面的协议提供了一种替代策略, 毛细管等电聚焦 (cIEF), 与传统的免疫印迹法相比有许多优点。这是一种基于抗体的、自动化的、快速的和定量的方法, 在超薄毛细管内发生完全的西方印迹过程。这种技术不需要凝胶转移到膜, 剥离的印迹, 或 x 射线胶片, 这是通常需要的常规免疫印迹法。在这里, 蛋白质被分离根据他们的充电 (电性点; pI), 使用少于微升 (400 nL) 总蛋白质裂解。电泳后, 蛋白质通过紫外线照射固定在毛细血管壁上, 其次是初级和次生 (辣根过氧化物酶 (HRP) 共轭) 抗体孵化, 通过增强的方法检测其结合化学发光 (ECL), 产生一个光信号, 可以捕获和记录的电荷耦合器件 (CCD) 相机。数字图像可以通过软件进行分析和量化 (峰值区域)。这个高吞吐量程序可以一次处理96个样本;高度敏感, 蛋白质检测在微量范围内;并产生高度可重复性的结果, 因为自动化。当样品数量 (例如组织样本和活检) 是一个限制因素时, 所有这些方面都非常有价值。该技术也有广泛的应用, 包括筛选药物或抗体, 生物标志物发现和诊断目的。
Introduction
毛细管电聚焦 (cIEF) 是一种基于毛细管的自动免疫分析法, 根据其电荷1、2、3来解析蛋白质。它具有高度的重现性, 能够快速、定量地解决蛋白质及其后 translationally 修饰亚型。它提出了一种替代传统方法, 如西方印迹。虽然西方印迹是非常好的确认存在丰富的蛋白质在容易接近的样品;可变性、时间消耗和准确定量所有目前的挑战, 特别是在检查生物组织样本。事实上, 变异是西方印迹中的一个固有问题, 因为有许多步骤, 例如 SDS 页凝胶的装载和运行, 蛋白质转移到膜上, 用各种试剂孵化 (e., 初级和中级抗体, ECL), 并发展到 x 射线胶片4。目前, 随着化学发光信号 (数字西部) 数字记录的实施, 西方印迹技术正在得到改进。最近, 一个自动化的西方印迹系统已经开发, 即毛细管西部, 这是一个更无免提和无凝胶系统。整个化验是自动化的在样品板材 (样品与所有必要的试剂) 的装载以后入系统3,4。该仪器将执行所有步骤, 如蛋白质分离, 固定化的蛋白质在毛细血管壁, 抗体孵化, 洗涤之间的不同步骤, 以及发展和量化的化学发光信号。因此, 这里提出的 cIEF 程序提供了更高的分辨率和灵敏度。
这种方法是敏感的, 因为信号可以产生和量化从 picograms 的蛋白质1。灵敏度高, 重现性好, 使该技术对临床样品的分析非常有用。它可以检测和区分后翻译修改 (例如,不同的磷酸化蛋白亚型) 的蛋白质。该技术已成功地用于解剖不同的信号通路4,5在临床研究旨在开发新的治疗癌症3, 它具有很大的潜力, 蛋白质生物标志物和药物发现.
Protocol
Representative Results
Discussion
蛋白质的敏感性和分辨力是生物蛋白质组学研究的关键。能够检测出细胞中微小数量的蛋白质是很有价值的。cIEF 可以为蛋白质及其亚型4的检测提供改进的灵敏度和分辨率。
该技术已成功地应用于许多蛋白质组研究报告5,6,7。尽管如此, 还是有一些限制与它相关, 例如, 并不是所有的主要?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢瑞典乌普萨拉大学的 Claesson 教授对发展这个项目的支持。此外, 作者感谢罗斯史密斯和莉娜 Claesson 威尔士, 乌普萨拉大学的批评阅读和建议, 以改善手稿。
Materials
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
Referências
- O’Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
- Aspinall-O’Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
- Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
- Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
- Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
- Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
- Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
- Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).
