Summary

Hochsensible und quantitativen Nachweis von Proteinen und deren Isoformen durch Kapillare isoelektrischen Fokussierung Methode

Published: September 19, 2018
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Summary

Kapillare isoelektrischen Fokussierung ist eine Antikörper-basierten, empfindsamen, hoher Durchsatz-Technik, ermöglicht detaillierte Charakterisierung von Proteinen und deren Isoformen von extrem kleinen biologischen Proben. Im folgenden beschreibt ein Protokoll für die Erkennung und Quantifizierung von spezifischen Proteinen und deren Isoformen robotisierte und automatisierte.

Abstract

Immunoblotting ist eine routinemäßige Technik in vielen Laboratorien zur Charakterisierung von Protein aus biologischen Proben geworden. Das folgende Protokoll bietet eine alternative Strategie, Kapillare isoelektrischen Fokussierung (cIEF), mit vielen Vorteilen im Vergleich zu herkömmlichen Immunoblotting. Dies ist ein Antikörper-basierte, automatisierte, schnelle und quantitative Methode, in der eine vollständige westlichen befleckenden Verfahren innerhalb einer ultradünnen Kapillare stattfindet. Diese Technik erfordert eine Gel auf eine Membran, Abisolieren von Flecken, übertragen und x-ray-Filme, die in der Regel für konventionelle Immunoblotting erforderlich sind. Hier werden Proteine getrennt nach ihrer Ladung (isoelektrischen Punkt, pI), Verwendung von weniger als einem Mikroliter (400 nL) des gesamten Proteins lysate. Nach Elektrophorese, sind Proteine auf die Kapillarwände durch UV-Licht-Behandlung, gefolgt von primären und sekundären (Meerrettich Peroxidase (HRP) konjugiert) immobilisierten Antikörper Inkubationszeit, dessen Bindung durch erkannt wird verbessert Chemilumineszenz (ECL), erzeugen ein Lichtsignal, die gefangen genommen und von einer – Coupled Ladegerät (CCD) Kamera aufgenommen werden kann. Das Digitalbild können analysiert und quantifiziert (Peakfläche) mit Software. Dieses Hochdurchsatz-Verfahren kann 96 Proben gleichzeitig bearbeiten; ist hochempfindlich, mit Proteindetektion im Bereich von Picogram; und produziert hoch reproduzierbare Ergebnisse durch Automatisierung. All diese Aspekte sind sehr wichtig, wenn die Menge von Proben (z.B., Gewebeproben und Biopsien) ein limitierender Faktor ist. Die Technik hat breitere Anwendungsmöglichkeiten, inklusive Screening von Drogen oder Antikörper, Entdeckung von Biomarkern und diagnostische Zwecke.

Introduction

Kapillare isoelektrischen Fokussierung (cIEF) ist eine automatisierte, Kapillar-basierte Immunoassay, der Proteine auf der Grundlage ihrer Ladung1,2,3aufgelöst wird. Es ist hoch reproduzierbare und auflösen, Proteine und ihre posttranslational modifizierten Isoformen schnell und quantitativ. Es stellt eine Alternative zu herkömmlichen Methoden wie westliche Beflecken. Während westliche Beflecken sehr gut ist für die Anwesenheit von reichlich Proteine in leicht zugänglichen Proben bestätigen; Variabilität, Verbrauch und genaue Quantifizierung aller anwesenden Herausforderungen, insbesondere bei der Prüfung, biologische Gewebeproben. In der Tat Variabilität ist eine inhärente Problem in westliche Beflecken, denn es gibt zahlreiche Schritte, wie laden und Ausführen von SDS-PAGE Gelen, Transfer von Proteinen auf der Membran, Inkubation mit verschiedenen Reagenzien (zB., primäre und sekundäre Antikörper, ECL), und die Entwicklung auf x-ray Film4. Derzeit ist die western Blot-Technik bei der Umsetzung der digitalen Aufnahmetechnik Chemolumineszenz Signale (Western digital) verbessern. Vor kurzem, ein automatisiertes western Blot-System wurde entwickelt, nämlich die Kapillare westlichen, die ein Freisprech- und Gel-freies System ist. Der gesamte Test ist automatisiert nach das Laden von einem Probenteller (Proben mit allen notwendigen Reagenzien) in das System3,4. Das Instrument wird alle Schritte wie Protein Trennung, Immobilisierung von Proteinen auf Kapillare Wand, Antikörper Inkubationen wäscht zwischen verschiedenen Stufen und Entwicklung und Quantifizierung der Chemilumineszenz-Signale. So bietet die Polizeichefs Verfahren hier vorgestellten höhere Auflösung und Empfindlichkeit.

Diese Methode ist empfindlich, da Signale generiert und von Pikogramm Proteine1quantifiziert werden können. Die hohe Empfindlichkeit mit hervorragende Reproduzierbarkeit macht diese Technologie sehr nützlich für die Analyse von klinischen Proben. Es kann zu erkennen sowie Post translationale Modifikation (z. B. verschiedene phosphorylierten Proteine Isoformen) von Proteinen zu unterscheiden. Diese Technologie wurde erfolgreich verwendet, um unterschiedliche Signalisierung Wege4,5 in klinischen Studien zur Entwicklung neuen Therapeutika in Krebs3zu sezieren, und es hat ein großes Potenzial für Protein Biomarker und Drug discovery .

Protocol

(1) Zell-Kultur, Stimulation und Lyse Hinweis: Diese Methode kann mit vielen Zelltypen verwendet werden. Um die Methode zu veranschaulichen, ist ein Beispiel für die Verwendung von menschlichen nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) beschrieben. Kultur Mediumwechsel auf Gelatine beschichtet, 10 cm Petrischalen in Endothelzellen basal Medium mit entsprechenden Ergänzung (siehe Tabelle der Materialien), und auch mit 5 % FCS, epidermalen Wachstumsfaktor (5 ng/mL), v…

Representative Results

Entwurf eines neuen Assays: Eine Test-Platte-Layout ist in Figur 1Adargestellt. Maximal, 96 Wells von 384-Well-Platte in Blöcken von 12 Brunnen für jede Bedingung (Antikörper) einsetzbar. Jeder Block von 12 Brunnen kann entweder von A1-A12 oder A13-A24 beginnen. Farbcodierte Zeilen erlauben es, Proben oder Reagenzien von einander zu unterscheiden. In der Assay-Vorlage (Abbildung 1 b), relevante Informationen d…

Discussion

Empfindlichkeit und Auflösung von Proteinen sind entscheidend für die Proteomik Forschung an biologischen Proben. Es ist großer Wert in der Lage, Proteine zu erkennen, die in kleinsten Mengen in den Zellen vorhanden sind. Polizeichefs bieten verbesserte Empfindlichkeit und Auflösung für den Nachweis von Proteinen und deren Isoformen4.

Diese Technologie wird erfolgreich in vielen Proteomic Forschung Berichte5,6</s…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Der Autor dankt Prof. Lena Claesson-Welsh, Universität Uppsala, Schweden für ihre Unterstützung für die Entwicklung dieses Projekts. Darüber hinaus dank der Autor Ross Smith und Lena Claesson-Welsh, Uppsala Universität für ihre kritischen Lektüre und Vorschläge zur Verbesserung der Handschrift.

Materials

NanoPro 1000 ProteinSimple
Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug ProteinSimple 040-972 Ampholyte premix
DMSO inhibitor mix ProteinSimple 040-510 Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used
Aqueous Inhibitor Mix ProteinSimple 040-482 Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used
pI standard ladder 3 ProteinSimple 040-646 For cIEF 1:60 dilution used
Sample diluent ProteinSimple 040-649
Antibody diluent  ProteinSimple 040-309
Wash concentrate ProteinSimple 041-108
Anolyte Refill ProteinSimple 040-337
Catholyte Refill ProteinSimple 040-338
Peroxide XDR ProteinSimple 041-084
Luminol ProteinSimple 040-652
Bicine/CHAPS Lysis Buffer ProteinSimple 040-764
Capillaries-Charge Separation (1 pack) for  ProteinSimple CBS700
Assay Plate/Lid Kit ProteinSimple 040-663
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)  Jackson ImmunoResearch  711-035-152 For cIEF used (1: 300)
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)  Jackson ImmunoResearch  715-035-150 For cIEF used (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody Cell Signaling 9101 For cIEF used (1: 50)
Pan Erk Primary Antibody Cell Signaling 9102 For cIEF used (1: 100)
Compass software ProteinSimple
HUVEC ATCC PCS-100-010
MV2 (EBM-2) PromoCell  C-22221 Endothelia cell basal medium
Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack PromoCell C-39221 Supplementation to MV2 above
VEGFA PeproTech 100-20
Long R3 IGF Sigma-Aldrich 85580C/I1146 Insulin-like growth factor
Bioruptor (Sonicator) Diagenode B01020001
BCA Protein Assay kit  Thermo Fischer Scientific 23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fischer Scientific NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) Thermo Fischer Scientific NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X) Thermo Fischer Scientific NP0006
Immobilon PVDF membrane Millipore IPVH00010
Microfuge tube vortexer
Centrifuge
Microtiter plate adapter for centrifuge
Pipettors 
Tips
Ice

Referências

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Padhan, N. Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method. J. Vis. Exp. (139), e56794, doi:10.3791/56794 (2018).

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