Summary

Изменение ролик трубки метод для точно локализованы и повторяющиеся прерывистый изображений во время долгосрочного культуры срезы мозга в замкнутой системе

Published: December 28, 2017
doi:

Summary

Представлены здесь метод трубки модифицированных ролика для культивирования и прерывистый с высоким разрешением изображений грызунов мозга ломтики в течение многих недель с точное перемещение на photoetched coverslips. Нейрональных жизнеспособность и морфология срез хорошо поддерживаются. Приложения полностью замкнутой системы с использованием вирусов для конкретного выражения типа клеток предоставляются.

Abstract

Искусственный мозг грызунов фрагменты полезны для изучения поведения клеточном и молекулярном нейронов и глии в среде, которая поддерживает многие из их обычной в естественных условиях взаимодействия. Фрагментов, полученных от различных линий трансгенные мыши или использование вирусных векторов для выражения дневно тегами белки или Репортеры в срезах мозга дикого типа позволяют с высоким разрешением изображений по микроскопии флуоресцирования. Хотя несколько методов были разработаны для визуализации мозга ломтиками, объединяя культуры срез с возможностью выполнения повторяющихся с высоким разрешением изображений конкретных клеток в живых фрагменты течение длительного времени создает проблемы. Это особенно верно, когда вирусных векторов используются для выражения экзогенных белков, так как лучше всего это делается в замкнутой системе для защиты пользователей и предотвращения перекрестного загрязнения. Как сообщается, простые изменения, внесенные метод культуры фрагмента ролика трубки мозга, которые позволяют для повторяющихся с высоким разрешением изображения срезов в течение многих недель в замкнутой системе. Культивирование срезы на photoetched coverslips позволяет использовать величинам точно и быстро переместить на сцену, чтобы идентичные поле изображения со временем до и после различных методов лечения. Для использования этого метода в сочетании с специфического окрашивания нейронов и выражение наблюдать изменения в архитектуре гиппокампа срез, вирусный опосредованной нейрональных выражение флуоресцентных белков и развития Кофилин патологии, приводятся примеры которая ранее наблюдалось в гиппокампе болезни Альцгеймера (AD) в ответ на лечение срез с олигомеров пептида амилоид β (значения).

Introduction

Первичной культуре диссоциированных нейронов из регионов грызунов мозга является важным инструментом, используемым исследователями наблюдать ответы на патологически замешан раздражителей. Однако такие исследования имеют недостаток глядя на нейроны в только 2D и без их глиальных системы поддержки. Кроме того если выросли в условиях очень высокой плотности (640 нейронов/мм2 или около 16% от площади поверхности), в которой она становится невозможным следовать случайных нарост дендритов или аксона для более чем на расстоянии короткой прогулки от его клетки тела, гиппокампа нейрональных жизнеспособность более 4 недель значительно снижается1, ограничивая использование диссоциированных культур для расширенного исследования возрастных патологий. Культивирование ломтиками, приготовленный из грызунов мозга является привлекательным вариантом, который преодолевает эти ограничения, поддерживая организованной клеток архитектуры и жизнеспособности для недель или месяцев. Условия для поддержания многих различных регионах грызунов мозга в ломтик культуры были описаны2.

Две основные методы широко используются для долгосрочных культуры срезы мозга: культивирования на мембраны на интерфейс воздуха жидкость3 или культивирования на coverslips в герметичных труб допускается для поворота в инкубаторе ролика предоставлять аэрации4. Ломтики, культивируемых на мембраны может быть непосредственно imaged с высоким разрешением флуоресцентной микроскопии с помощью вертикально микроскоп и воды погружение цели5. Кроме того фрагменты, культивируемых на мембраны были переданы стекла дно блюда для достижения хорошего разрешения с помощью инвертированного микроскопа6дендритных шипиков. Однако оба метода визуализации ломтиками, выращенных на мембраны являются открытые системы, которые требуют среднего изменения и часто используют антибиотики или противогрибковые для предотвращения или уменьшения загрязнения5,6. Ломтики на мембрану в воздушной среде интерфейса поддерживают отличные морфологии и выживания, но возвращение в строго определенные места во время повторяющихся изображений с высоким увеличением является чрезвычайно сложной, если эксперимент следит только небольшие группы клеток выражая флуоресцентных маркеров. Хотя ломтиками, выращенных на мембраны были использованы с вирусный опосредованной выражением трансгенов5,6, протоколы биобезопасности может потребовать систему закрытых культуры использоваться для некоторых вирусных векторов, которые используются для выражая дневно tagged белков и Репортеры физиологии клетки. Кроме того погружение цели требуют очистки между образцами, последовавших в культуре5. Один из основных приложений мембраны интерфейс культур является объединение с высоким разрешением изображения с электрофизиологии на один раз точки7.

Метод трубки ролик с coverslips внутри пластиковой трубки не разрешают любой электрофизиологии или высоким разрешением изображений без удаления coverslip. Таким образом этот метод чаще всего применяется для долгосрочных исследований, в которых после фиксации замечания были сделаны8. Описанные здесь является метод, который использует техника культура трубки ролика, но на пробуренных из трубы с кусочками на coverslips, которые могут быть многократно imaged для покуда культуры сохраняются. Замкнутые системы требует не среднего изменения для обработки изображений и использует photoetched coverslips предоставлять величинам, которые позволяют изображений с высоким увеличением, дней или недель, точные ранее отображаемого поля.

Мы применяем этот метод для изучения изменений в грызунов гиппокампа, основных мозга региона, участвующих в память и обучение. Грызунов гиппокампа часто рассматривается как модель для патологических или возрастные изменения, наблюдаемые в ходе развития когнитивных нарушений9, например те, которые происходят в AD. Наш метод особенно хорошо подходит для изучения патологические изменения, которые развиваются в один срез с течением времени в ответ на экологические изменения, такие как увеличение значения пептиды, который является характеристикой AD8. Один патологии, связанные с AD мозга человека и грызунов является наличие Кофилин актина агрегатов и стержней, последний содержащие пучки нитей в котором Кофилин и актина находятся в молярное соотношение 1:110,11, 12. стержни наблюдались в фиксированных срезах гиппокампа крысы, после Aβ лечения, а также в пределах кусочек живой грызунов мозга выразив Кофилин GFP подвержены гипоксии8, и они могут способствовать синаптических дисфункции, видели в AD и инсульта. Здесь мы используем этот новый метод культивирования соблюдать время курс и распределения в рамках ломтики выраженной экзогенных химерных флуоресцентных белков, представленный различных вирусов. Затем мы используем нейрональных конкретное выражение конструкцию репортер Кофилин следить за развитием Кофилин стержня и совокупных патологии в срезах гиппокампа в ответ на лечение с растворимых значения олигомеров (oAβ).

Protocol

Использование животных следует утвержденным селекции и протоколы использования животных, которые соответствуют животное уход и использовать руководящие принципы из университета штата Колорадо. Примечание: Ниже протокол описывает метод подготовки и культуры для долг?…

Representative Results

Чтобы определить, насколько точно могут быть использованы отсчета к reimage же клеток в тех же областях с течением времени, мы рассмотрели ломтиками, выращенных на photoetched coverslips(рис. 6). Нейроны были визуализированы пятнать с краской жизненно (100 Нм 2 …

Discussion

Ролик трубки метод, описанный здесь позволяет для долгосрочного культивирования и высоким разрешением живой изображений нарезанный мозговой ткани. Одной из основных проблем с техникой фрагмент как применяется здесь находится в монтаж и обслуживание ломтиками. Coverslip покрытия, которые…

Materials

Bottoms from 15 cm culture dishes VWR Scientific 25384-326
Phillips Head Machine Screws (#10-32) Ace Hardware 2.5" long and 3/16" in diameter
Flat Washers #10 ACE Hardware
Machine Screw Nuts (#10-32) ACE Hardware
Rubber Grommets  ACE Hardware 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD
Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) ACE Hardware Cut to 1.8" length
Lock Washer #10 ACE Hardware
Drill Press, 5 speed  Ace Hardware ProTech Model 1201
Nunclon Delta Flat-Sided Tubes VWR 62407-076
Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm  Ace Hardware Diablo freud brand Drill bits for cutting plastic.
Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm Ace Hardware
Wood file, 1/4" round Ace Harware
Spring clips, 16 mm snap holder Ace Hardware
Swivel Head Deburring Tool, 5" Ace Hardware 26307
Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) Grace Bio-Labs 666581 0.5 mm Thickness
6 mm hole punch Office Max
12 mm hole punch thepunchbunch.com
70% Ethanol
Phototeched Coverslips, 12 mm diameter Bellco Glass, Inc. 1916-91012
Bunsen Burner
Absolute Ethanol
Nanopure Water
3-aminopropyltriethoxylane Sigma-Aldrich A3648
Acetone Sigma-Aldrich 179124
#5 Dumont Forceps Fine Science Tools 11251-30
McIlwain Tissue Chopper Ted Pella, Inc. 10180
Double Edge Razor Blades Ted Pella, Inc. 121-6
Whatman Filter Paper VWR 28450-182 Cut into 5.8 cm diameter circles
Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) Ted Pella, Inc. 10501-10 Cut into 5.8 cm diameter circles
#21 Surgical Blade VWR Scientific 25860-144
#5 Dumont Forceps Fine Science Tools 11251-30
Spatula, stainless with tapered end VWR 82027-518
Gey's Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich G9779 
 Glucose ThermoFisher Scientific 15023-021 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized
Chicken Plasma Cocalico Biologicals 30-0300-5L Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at  -80 °C.
Thrombin, Bovine Fisher 60-516-01KU 150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C.
Cell Roller System Bellco Biotech SciERA
Roller Incubator Forma Model 3956
N21-MAX ThermoFisher Scientific AR008
Pen/Strep (100X) ThermoFisher Scientific 15140122
200 mM Glutamine ThermoFisher Scientific 25030081
Glucose ThermoFisher Scientific 15023-021 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized
Neurobasal A ThermoFisher Scientific 10888-022  Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep.
Third generation lentivirus packaging Life Technologies K4975-00
159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) EMD Millipore
Lentiviral cloning system (InFusion) Clonetech
Plasmids 30323, 50856, 51279 Addgene
Neuronal cell viability dye (NeuO) Stemcell technologies 1801 Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C
Inverted microscope Olympus IX83
Microscope objectives Olympus air: 4X, 20; oil: 40X, 60X,
Spinning disc confocal system Yokagawa CSU22
Microscope EMCCD camera Photometrics Cascade II
Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage ASI
Microscope lasers and integration Intelligent Imaging Innovations
HEK293T cells American Type Culture Collection CRL-3216
Human Plasmin Sigma Aldrich P1867 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C.

Referências

  1. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
  2. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neurociência. 305, 86-98 (2015).
  3. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  4. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  5. Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
  6. Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
  7. Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -. P., Béīque, J. -. C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
  8. Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
  9. Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10365-10370 (2013).
  10. Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
  11. Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
  12. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
  13. He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
  14. Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
  15. Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
  16. Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
  17. Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
  18. Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
  19. Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
  20. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  21. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
  22. Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
  23. Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
  24. Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
  25. Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
  26. Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
  27. Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
  28. Stine, W. B., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
  29. Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
  30. Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
  31. Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
  32. Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
  33. Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).

Play Video

Citar este artigo
Fixman, B. B., Babcock, I. W., Minamide, L. S., Shaw, A. E., Oliveira da Silva, M. I., Runyan, A. M., Maloney, M. T., Field, J. J., Bamburg, J. R. Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System. J. Vis. Exp. (130), e56436, doi:10.3791/56436 (2017).

View Video