Summary

Metodo del tubo rullo modificate per Imaging intermittente precisamente localizzata e ripetitivi durante la coltura a lungo termine delle fette di cervello in un sistema chiuso

Published: December 28, 2017
doi:

Summary

Presentato qui è un metodo di tubo rullo modificate per la coltura e fette di imaging ad alta risoluzione intermittente del cervello del roditore sopra molte settimane con riposizionamento preciso sulle lamelle di fotoincisioni. Vitalità neuronale e fetta morfologia sono ben tenute. Vengono fornite applicazioni di questo sistema completamente chiusa usando i virus per espressione specifica del tipo di cella.

Abstract

Fette del cervello del roditore coltivate sono utili per studiare il comportamento cellulare e molecolare dei neuroni e cellule gliali in un ambiente che conserva ancora molte delle loro interazioni normale in vivo . Fette ottenute da una varietà di linee di topi transgenici o uso di vettori virali per l’espressione di proteine fluorescente etichettate o reporter in fettine di cervello di tipo selvaggio consentono per imaging ad alta risoluzione da microscopia di fluorescenza. Sebbene diversi metodi sono stati sviluppati per l’imaging di fettine di cervello, che unisce la cultura fetta con la possibilità di eseguire ripetitivo imaging ad alta risoluzione di cellule specifiche a fette dal vivo nel corso di lunghi periodi di tempo ha posto problemi. Questo è particolarmente vero quando vettori virali sono usati per l’espressione di proteine esogene poiché questo è meglio farlo in un sistema chiuso per proteggere gli utenti e di evitare la contaminazione incrociata. Semplici modifiche apportate al metodo di coltura a rulli tubo cervello fetta che consentono per imaging ad alta risoluzione ripetitivo delle fette sopra molte settimane in un sistema chiuso sono segnalate. Coltura fette su vetrini coprioggetti fotoincisioni consente l’utilizzo dei marchi fiducial rapidamente e precisamente riposizionare il palco per il campo identico di immagine nel tempo prima e dopo i trattamenti differenti. Sono riportati alcuni esempi per l’utilizzo di questo metodo combinato con colorazione neuronale specifica espressione per osservare i cambiamenti nell’architettura di fettine di ippocampo, espressione di un neurone virale-mediata di proteine fluorescenti e lo sviluppo di patologia cofilina, che precedentemente è stata osservata nell’ippocampo del morbo di Alzheimer (annuncio) in risposta al trattamento della fetta con oligomeri del peptide amiloide-β (Aβ).

Introduction

Colture primarie di neuroni dissociati dalle regioni del cervello del roditore sono un importante strumento usato dai ricercatori per osservare le risposte alla patologico implicato stimoli. Tuttavia, tali studi hanno lo svantaggio di guardando i neuroni in 2D solo e senza loro glial sistema di supporto. Inoltre, a meno che non coltivate in condizioni di densità molto alta (640 neuroni/mm2 o circa il 16% della superficie) in cui esso diventa impossibile seguire la conseguenza casuale di un dendrite o assone per più di una breve distanza dal suo corpo cellulare, hippocampal vitalità neuronale oltre 4 settimane diminuisce significativamente1, limitando l’uso di colture dissociate per gli studi estesi delle patologie età-correlate. Alla coltura delle fette preparati dal cervello del roditore è un’opzione attraente che supera queste limitazioni mantenendo un’architettura cellulare organizzata e vitalità per settimane o mesi. Condizioni per il mantenimento di molte regioni differenti del cervello del roditore nella fetta di cultura sono stati descritti2.

Due metodi principali sono ampiamente usati per la coltura a lungo termine di fette del cervello: coltura su membrane all’ interfaccia aria-liquido3 o coltura sulle lamelle in provette sigillate permesso di ruotare in un incubatore a rullo per fornire aerazione4. Fette coltivate sulle membrane possono essere imaged direttamente con microscopia di fluorescenza ad alta risoluzione utilizzando un microscopio dritto e acqua immersione obiettivi5. In alternativa, fette coltivate sulle membrane sono stati trasferiti a piatti di fondo di vetro per ottenere una buona risoluzione delle spine dendritiche usando un microscopio invertito6. Tuttavia, entrambi i metodi di imaging fette coltivate sulle membrane sono sistemi aperti che richiedono modifiche medie e spesso utilizzano antimicotico e/o antibiotici per prevenire o ridurre la contaminazione5,6. Fette su una membrana all’interfaccia aria-medio mantengono eccellente morfologia e sopravvivenza, ma tornando a posizioni precise durante la formazione immagine ripetitiva ad alto ingrandimento è estremamente difficile a meno che l’esperimento è seguito solo piccoli gruppi di cellule esprimendo un marcatore fluorescente. Sebbene fette coltivate sulle membrane sono stati utilizzati con espressione virale-mediata di transgeni5,6, protocolli di biosicurezza potrebbero richiedere un sistema di coltura chiuso essere impiegato per alcuni vettori virali che sono utilizzati per esprimendo la fluorescente tagged proteine e reporter di fisiologia cellulare. Inoltre, obiettivi di immersione richiedono una decontaminazione tra i campioni che verranno seguite nella cultura5. Una delle principale applicazioni del culture interfaccia membrana sta combinando imaging ad alta risoluzione con elettrofisiologia a singola volta punti7.

Il metodo del tubo rullo con lamelle all’interno del tubo di plastica non consente alcun elettrofisiologia o imaging ad alta risoluzione senza rimuovere il vetrino coprioggetti. Pertanto, questo metodo è stato applicato più spesso a studi a lungo termine in cui sono state fatte osservazioni post-fissazione,8. Qui descritto è un metodo che utilizza la tecnica della coltura tubo rullo ma sui tubi forati-out con fette sulle lamelle che possono essere imaged in modo ripetitivo per finchè le culture vengono mantenuto. Il sistema chiuso non richiede alcun cambiamento medio per l’imaging e utilizza vetrini coprioggetti fotoincisioni per fornire fiducial marchi che consentono di imaging ad alto ingrandimento, dopo giorni o settimane, i precisi campi precedentemente imaged.

Applichiamo questo metodo per esaminare i cambiamenti nel roditore ippocampo, una regione del cervello più importanti coinvolta nella memoria e l’apprendimento. L’ippocampo roditore è spesso studiata come un modello per patologiche o età-correlate cambiamenti osservati durante lo sviluppo di danno conoscitivo9, come quelle che si verificano in annuncio. Il nostro metodo è particolarmente adatto per studiare i cambiamenti patologici che si sviluppano all’interno di una singola fetta nel tempo in risposta ai cambiamenti ambientali, come aumenti di peptidi Aβ, che è caratteristica della AD8. Una patologia connessa con il cervello umano e del roditore dell’annuncio è la presenza di aggregati cofilina-actina e le bacchette, quest’ultimi contiene fasci di filamenti in cui cofilina e actina sono presenti un 1:1 rapporto molare10,11, 12. canne sono state osservate in fisse fette dell’ippocampo del ratto dopo il trattamento di Aβ, così come all’interno di una fetta di cervello del roditore vivo esprimendo cofilina-GFP sottoposti ad ipossia8, e possono contribuire alla disfunzione sinaptica ad esempio ad e di colpo. Qui usiamo questo nuovo metodo di coltura per osservare il decorso e la distribuzione all’interno di fette di proteine fluorescenti chimeriche esogene espresse introdotte da virus diversi. Utilizziamo quindi l’espressione specifica di un neurone di un costrutto di reporter cofilina di seguire lo sviluppo della cofilina rod e aggregata patologia nelle fette hippocampal in risposta al trattamento con oligomeri solubili di Aβ (Aβo).

Protocol

L’uso di animali segue approvato allevamento ed i protocolli di uso animale conformi alla cura degli animali e utilizzare le linee guida della Colorado State University. Nota: Il protocollo sottostante descrive il metodo di preparazione e cultura per l’incubazione a lungo termine e intermittente imaging di fette hippocampal. Una sola fetta hippocampal è collegata a un vetrino coprioggetti fotoincisioni appositamente preparati utilizzando un coagulo di plasma, e poi le lamelle sono sigillate s…

Representative Results

Per determinare con precisione come fiducial contrassegni possono essere utilizzati per creare una nuova immagine delle stesse cellule all’interno dei campi stessi nel corso del tempo, abbiamo esaminato fette coltivate su vetrini coprioggetti fotoincisioni (Figura 6A). I neuroni sono stati visualizzati tramite colorazione con un colorante vitale (100 nM per 2 h; non macchia le cellule non neuronali), che scompare da neuroni nel tempo senza da…

Discussion

Il metodo del tubo rullo descritto qui consente la coltura a lungo termine e di imaging ad alta risoluzione dal vivo del tessuto di cervello affettato. Un grosso problema con la tecnica di fetta come applicato qui è nel montaggio e manutenzione delle fette. Rivestimenti di vetrino coprioggetto che supportano fetta adesione, promuovere la fetta assottigliamento migliorando la conseguenza dei neurites e migrazione delle cellule fuori la fetta; così, abbiamo evitato l’uso di questi substrati. L’inserimento di gruppi ammin…

Materials

Bottoms from 15 cm culture dishes VWR Scientific 25384-326
Phillips Head Machine Screws (#10-32) Ace Hardware 2.5" long and 3/16" in diameter
Flat Washers #10 ACE Hardware
Machine Screw Nuts (#10-32) ACE Hardware
Rubber Grommets  ACE Hardware 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD
Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) ACE Hardware Cut to 1.8" length
Lock Washer #10 ACE Hardware
Drill Press, 5 speed  Ace Hardware ProTech Model 1201
Nunclon Delta Flat-Sided Tubes VWR 62407-076
Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm  Ace Hardware Diablo freud brand Drill bits for cutting plastic.
Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm Ace Hardware
Wood file, 1/4" round Ace Harware
Spring clips, 16 mm snap holder Ace Hardware
Swivel Head Deburring Tool, 5" Ace Hardware 26307
Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) Grace Bio-Labs 666581 0.5 mm Thickness
6 mm hole punch Office Max
12 mm hole punch thepunchbunch.com
70% Ethanol
Phototeched Coverslips, 12 mm diameter Bellco Glass, Inc. 1916-91012
Bunsen Burner
Absolute Ethanol
Nanopure Water
3-aminopropyltriethoxylane Sigma-Aldrich A3648
Acetone Sigma-Aldrich 179124
#5 Dumont Forceps Fine Science Tools 11251-30
McIlwain Tissue Chopper Ted Pella, Inc. 10180
Double Edge Razor Blades Ted Pella, Inc. 121-6
Whatman Filter Paper VWR 28450-182 Cut into 5.8 cm diameter circles
Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) Ted Pella, Inc. 10501-10 Cut into 5.8 cm diameter circles
#21 Surgical Blade VWR Scientific 25860-144
#5 Dumont Forceps Fine Science Tools 11251-30
Spatula, stainless with tapered end VWR 82027-518
Gey's Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich G9779 
 Glucose ThermoFisher Scientific 15023-021 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized
Chicken Plasma Cocalico Biologicals 30-0300-5L Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at  -80 °C.
Thrombin, Bovine Fisher 60-516-01KU 150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C.
Cell Roller System Bellco Biotech SciERA
Roller Incubator Forma Model 3956
N21-MAX ThermoFisher Scientific AR008
Pen/Strep (100X) ThermoFisher Scientific 15140122
200 mM Glutamine ThermoFisher Scientific 25030081
Glucose ThermoFisher Scientific 15023-021 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized
Neurobasal A ThermoFisher Scientific 10888-022  Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep.
Third generation lentivirus packaging Life Technologies K4975-00
159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) EMD Millipore
Lentiviral cloning system (InFusion) Clonetech
Plasmids 30323, 50856, 51279 Addgene
Neuronal cell viability dye (NeuO) Stemcell technologies 1801 Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C
Inverted microscope Olympus IX83
Microscope objectives Olympus air: 4X, 20; oil: 40X, 60X,
Spinning disc confocal system Yokagawa CSU22
Microscope EMCCD camera Photometrics Cascade II
Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage ASI
Microscope lasers and integration Intelligent Imaging Innovations
HEK293T cells American Type Culture Collection CRL-3216
Human Plasmin Sigma Aldrich P1867 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C.

Referências

  1. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
  2. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neurociência. 305, 86-98 (2015).
  3. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  4. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  5. Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
  6. Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
  7. Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -. P., Béīque, J. -. C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
  8. Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
  9. Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10365-10370 (2013).
  10. Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
  11. Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
  12. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
  13. He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
  14. Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
  15. Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
  16. Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
  17. Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
  18. Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
  19. Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
  20. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  21. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
  22. Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
  23. Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
  24. Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
  25. Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
  26. Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
  27. Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
  28. Stine, W. B., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
  29. Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
  30. Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
  31. Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
  32. Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
  33. Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).

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Citar este artigo
Fixman, B. B., Babcock, I. W., Minamide, L. S., Shaw, A. E., Oliveira da Silva, M. I., Runyan, A. M., Maloney, M. T., Field, J. J., Bamburg, J. R. Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System. J. Vis. Exp. (130), e56436, doi:10.3791/56436 (2017).

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