Summary

Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas

Published: July 24, 2017
doi:

Summary

O ensaio de um híbrido de levedura modificado descrito aqui é uma extensão do ensaio de híbrido (Y1H) de levedura clássico para estudar e validar a interação de proteína-proteína heteromérica-DNA em um sistema heterólogo para qualquer estudo de genômica funcional.

Abstract

Ao longo dos anos, o ensaio de um híbrido de levedura provou ser uma técnica importante para a identificação e validação de interações físicas entre proteínas, como fatores de transcrição (TFs) e seu alvo de DNA. O método apresentado aqui utiliza o conceito subjacente do Y1H, mas é modificado para estudar e validar os complexos de proteínas que se ligam ao DNA alvo. Assim, é referido como o ensaio de um híbrido (Y1.5H) de levedura modificado. Este ensaio é rentável e pode ser facilmente realizado em uma configuração regular de laboratório. Embora utilizando um sistema heterólogo, o método descrito pode ser uma ferramenta valiosa para testar e validar a ligação do complexo de proteína heteromérica ao (s) alvo (s) de DNA da genômica funcional em qualquer sistema de estudo, especialmente a genômica vegetal.

Introduction

Em geral, para entender as interações proteína-DNA, o teste Y1H é o sistema preferido usado com sucesso em uma configuração laboratorial 1 . O ensaio básico de Y1H envolve dois componentes: a) uma construção repórter com ADN de interesse clonado com sucesso a montante de um gene que codifica uma proteína repórter; E b) uma construção de expressão que irá gerar uma proteína de fusão entre o TF de interesse e um domínio de ativação da transcrição de fermento (AD). O DNA de interesse é comumente referido como "isca", enquanto a proteína de fusão é conhecida como "presa". Nos últimos anos, várias versões do ensaio Y1H foram desenvolvidas para atender às necessidades específicas com suas próprias vantagens 2 . O ensaio Y1H existente pode ser implementado com sucesso para identificar e validar a interação de uma proteína de cada vez com a isca de DNA, mas não possui a capacidade de identificar interações heterodiméricas ou multimeric proteína-DNA.

"> O método descrito aqui é uma versão modificada dos pesquisadores habilitados para Y1H para estudar simultaneamente múltiplas proteínas que se ligam à sua sequência de DNA alvo. O objetivo deste ensaio é expressar a proteína de interesse com um domínio de ativação (pDEST22: TF) e avaliar a ativação das regiões de DNA candidatas fundidas a um repórter na presença e / ou ausência do parceiro de proteína que interage (pDEST32ΔDBD-TF) no sistema de levedura. Esse ensaio nos permitirá determinar se a interação entre esses dois As proteínas são necessárias para a ativação do alvo. Este é um sistema compatível com clonagem GATEWAY e, portanto, é viável para uso em uma configuração regular de laboratório. Este protocolo baseia-se na transformação direta, o que proporciona a facilidade de co-transformação de diferentes TFs em um sistema de levedura . Assim, é uma estratégia vantajosa para validar os complexos de proteína que se ligam aos seus possíveis alvos de DNA para validação molecular e funcional in vitro fOu qualquer sistema. As técnicas atuais, como os métodos de purificação por afinidade em Tandem (TAP), são caras e intensivas em mão-de-obra, mas permitem a detecção de hetrocomplexos protéicos em grande escala 3 , 4 , 5 . Este um híbrido de levedura modificado pode ser realizado com sucesso em uma configuração de laboratório regular em pequena escala ( Figura 1 ) e também é rentável. O ensaio Y1.5H pode facilitar pesquisadores em toda a comunidade para testar e validar sua hipótese para definir o papel da ligação do complexo de proteína multimérica a um alvo de DNA comum usando um sistema heterólogo. Com base nos achados, a hipótese poderia ser validada in vivo no sistema de estudo preferido. Recentemente, utilizamos essa abordagem para definir o papel de um TF e seu modo de ação para regular a floração em Arabidopsis 6 .

Protocol

1. Preparação do plasmídeo Construir e Reportagem Amplificação por PCR as regiões promotoras / "fragmentos" (de preferência ~ 250 – 500 pb) do ADN alvo a serem analisados ​​para clonagem adicional no vector de entrada usando E. coli (TOP10). Após confirmação de seqüenciamento, subclone o clone positivo em um vetor de expressão pGLacZi compatível 7 conforme descrito anteriormente 8 , <sup class="xref"…

Representative Results

O procedimento geral de montagem de placas para a co-transformação de regiões de DNA nas células de levedura com proteína de interesse ( Figura 2 ). A configuração da placa pode ser modificada de acordo com a necessidade do experimento e o número de regiões / fragmentos de DNA testados. Após o dia 5 do protocolo, uma placa bem cultivada e positiva deve ser visível como na Figura 3 . Em nosso estudo, a região promotor…

Discussion

O procedimento padrão Y1H existente é adequado para identificar uma única presa de proteína que se liga à sua isca de DNA. Com várias modificações técnicas, o sistema existente foi aproveitado para definir redes reguladoras de transcrição. No entanto, os TFs são conhecidos por funcionar como uma parte dos complexos envolvendo duas ou mais TFs ou proteínas, com apenas alguns dos TF capazes de se ligar ao DNA. As proteínas ou TFs que possuem apenas os domínios de ligação à proteína e a falta de capacida…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos SS Wang, M. Amar e A. Galla pela leitura crítica do manuscrito. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob números de prêmios RO1GM067837 e RO1GM056006 (para a SAK). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente as visões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Materials

pDEST22 vector Invitrogen PQ1000101 Pro-Quest Two hybrid system kit
pDEST32delatDBD Invitrogen PQ1000102 Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Invitrogen K240020
YM4271 Strain Clontech K1603-1 MATCHMAKER One-Hybrid System
pEXP-AD502 Invitrogen PQ1000101 Pro-Quest Two hybrid system kit
GATEWAY LR Clonase II enzyme mix Invitrogen 11791020
YPDA media Clontech 630410
SD-Agar Clontech 630412
SD minimal media Clontech 630411
Uracil DO Supplement Clontech 630416
Tryptophan Do Supplement Clontech 630413
Tris Base Fisher Scientific BP152-1
EDTA Fisher Scientific S311-500
LiAc Sigma-Aldrich L4158
Saplmon Sperm (10mg/ml) Invitrogen 15632011
96 well round bottom Plate Greiner bio-one 650101
PEG3350 Sigma-Aldrich 1546547
96-deep well block USA Scientific 1896-2000
Sealable Foil USA Scientific 2923-0110
Araseal Excel Scientific B-100
2-mercaptoethanol Fisher Scientific 034461-100
ONPG Sigma-Aldrich 73660
Na2CO3 Sigma-Aldrich 223484
Na2HPO4  Sigma-Aldrich S3264
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S3139
KCL Fisher Scientific BP366-500
MgSO4  Sigma-Aldrich 83266
HCL Fisher Scientific SA54-4
Drybath Thermo Fischer
Voretx Thermo Fischer
Centrifgue Eppendorf Centrifuge 5810R
Plate Reader Molecular Device SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer
Incubator Thermo Fisher Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees
Shaker Incubator New Brunswick
Water Bath Thermo Fisher IsoTemp 205
Puncher
50 ml Falocn BD Falcon
Beaker Nalgene
Flask Nalgene
Petriplates (150mm) Greiner bio-one

Referências

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  2. Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
  3. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  4. Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  5. Gavin, A. -. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  6. Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
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  8. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
  9. Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
  10. Klein, P., Dietz, K. -. J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
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Citar este artigo
Tripathi, P., Pruneda-Paz, J. L., Kay, S. A. A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies. J. Vis. Exp. (125), e56080, doi:10.3791/56080 (2017).

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