Summary

Un lievito modificato - un sistema ibrido per studi di interazione tra DNA e proteine ​​eteromeriche

Published: July 24, 2017
doi:

Summary

Il saggio di un ibrido di lievito modificato qui descritto è un'estensione del saggio classico del lievito un ibrido (Y1H) per studiare e convalidare l'interazione heteromera della proteina-complesso del DNA in un sistema eterologo per qualsiasi studio genomico funzionale.

Abstract

Nel corso degli anni il test di un ibrido del lievito ha dimostrato di essere una tecnica importante per l'identificazione e la convalida delle interazioni fisiche tra proteine ​​quali i fattori di trascrizione (TFs) e il loro target di DNA. Il metodo presentato qui utilizza il concetto sottostante del Y1H ma è modificato ulteriormente per studiare e validare complessi proteici legati al loro DNA target. Quindi, viene definito come il lievito modificato un ibrido (Y1.5H). Questo test è economico e può essere facilmente eseguito in un normale ambiente di laboratorio. Sebbene utilizzando un sistema eterologo, il metodo descritto potrebbe essere un valido strumento per testare e convalidare il complesso proteomico eteromerico legato al loro target di DNA per la genomica funzionale in qualsiasi sistema di studio, in particolare la genomica vegetale.

Introduction

In generale, per comprendere le interazioni proteine-DNA, il saggio Y1H è il sistema preferito utilizzato con successo in un ambiente di laboratorio 1 . Il test Y1H di base coinvolge due componenti: a) un costruttore di reporter con DNA di interesse con successo clonato a monte di un gene che codifica una proteina reporter; E b) un costrutto di espressione che genera una proteina di fusione tra il TF di interesse e un dominio di attivazione della trascrizione di lieviti (AD). Il DNA di interesse è comunemente indicato come 'esca' mentre la proteina di fusione è conosciuta come 'preda'. Negli ultimi anni sono state sviluppate più versioni del test Y1H per soddisfare le esigenze specifiche con i propri vantaggi 2 . Il test Y1H esistente può essere implementato con successo per identificare e convalidare l'interazione di una proteina alla volta con l'esca del DNA, ma manca la capacità di identificare interazioni tra proteine ​​e DNA eterodimeriche o multimeriche.

"> Il metodo descritto qui è una versione modificata dei ricercatori che consentono Y1H di studiare contemporaneamente più proteine ​​legate alla loro sequenza di DNA target. L'obiettivo di questo test è quello di esprimere la proteina di interesse con un dominio di attivazione (pDEST22: TF) e valutare l'attivazione delle regioni del DNA candidato fuso ad un reporter in presenza e / o assenza del partner proteico interagente (pDEST32ΔDBD-TF) nel sistema di lievito.Questo dosaggio ci permetterà di determinare se l'interazione tra questi due Proteine ​​è necessario per l'attivazione del bersaglio.Questo è un sistema compatibile di clonazione GATEWAY e quindi è possibile utilizzare in un ambiente di laboratorio regolare.Questo protocollo è basato sulla trasformazione diretta, che fornisce la facilità di co-trasformazione di TF differenti in un sistema di lievito , Quindi è una strategia vantaggiosa per convalidare i complessi proteici che si legano ai loro possibili bersagli del DNA per la convalida molecolare e funzionale in vitro fO qualsiasi sistema. Le tecniche attuali quali i metodi di purificazione di affinità tandem (TAP) sono costosi e impegnativi nel lavoro, ma consentono la rilevazione di hetrocomplex proteici su larga scala 3 , 4 , 5 . Questo ibrido di lievito modificato può essere eseguito con successo in una regolazione regolare di laboratorio su piccola scala ( figura 1 ) ed è anche conveniente. Il test Y1.5H può facilitare i ricercatori in tutta la comunità per verificare e convalidare la loro ipotesi per definire il ruolo del complesso proteico multimerico legato ad un comune obiettivo del DNA utilizzando un sistema eterologo. Sulla base dei risultati, l'ipotesi potrebbe essere convalidata in vivo nel sistema di studio preferito. Recentemente, abbiamo utilizzato questo approccio per definire il ruolo di un TF e il suo modo di azione per regolare la fioritura in Arabidopsis 6 .

Protocol

1. Costruire e preparare il Plasmide Reporter PCR amplificano le regioni / "frammenti" del promotore (preferibilmente ~ 250-500 bp) del DNA target da analizzare per ulteriore clonazione nel vettore di ingresso usando E. coli (TOP10). Dopo la conferma della sequenza, subclone il clone positivo in un vettore di espressione pGLacZi compatibile 7 come descritto precedentemente 8 , 9 , <…

Representative Results

La procedura generale di preparazione delle piastre per la co-trasformazione delle regioni del DNA nelle cellule del lievito con proteina di interesse ( Figura 2 ). La configurazione del piatto può essere modificata in base alla necessità dell'esperimento e del numero di regioni / frammenti di DNA sperimentati. Dopo il giorno 5 del protocollo dovrebbe essere visibile una piastra ben sviluppata e positiva come nella figura 3</strong…

Discussion

La procedura standard esistente Y1H è idonea per identificare una singola preda di proteine ​​legata all'esca del DNA. Con varie modifiche tecniche, il sistema esistente è stato sfruttato per la definizione di reti regolatorie trascrizionali. Tuttavia, TFs sono noti per funzionare come parte di complessi che coinvolgono due o più TF o proteine, con solo alcuni dei TF in grado di legarsi al DNA. Le proteine ​​oi TF che possiedono solo i domini leganti alla proteina e che non dispongono della capacità di l…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo SS Wang, M. Amar e A. Galla per una lettura critica del manoscritto. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall'Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Salute con i numeri di premio RO1GM067837 e RO1GM056006 (a SAK). Il contenuto è esclusivamente responsabile degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Salute.

Materials

pDEST22 vector Invitrogen PQ1000101 Pro-Quest Two hybrid system kit
pDEST32delatDBD Invitrogen PQ1000102 Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Invitrogen K240020
YM4271 Strain Clontech K1603-1 MATCHMAKER One-Hybrid System
pEXP-AD502 Invitrogen PQ1000101 Pro-Quest Two hybrid system kit
GATEWAY LR Clonase II enzyme mix Invitrogen 11791020
YPDA media Clontech 630410
SD-Agar Clontech 630412
SD minimal media Clontech 630411
Uracil DO Supplement Clontech 630416
Tryptophan Do Supplement Clontech 630413
Tris Base Fisher Scientific BP152-1
EDTA Fisher Scientific S311-500
LiAc Sigma-Aldrich L4158
Saplmon Sperm (10mg/ml) Invitrogen 15632011
96 well round bottom Plate Greiner bio-one 650101
PEG3350 Sigma-Aldrich 1546547
96-deep well block USA Scientific 1896-2000
Sealable Foil USA Scientific 2923-0110
Araseal Excel Scientific B-100
2-mercaptoethanol Fisher Scientific 034461-100
ONPG Sigma-Aldrich 73660
Na2CO3 Sigma-Aldrich 223484
Na2HPO4  Sigma-Aldrich S3264
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S3139
KCL Fisher Scientific BP366-500
MgSO4  Sigma-Aldrich 83266
HCL Fisher Scientific SA54-4
Drybath Thermo Fischer
Voretx Thermo Fischer
Centrifgue Eppendorf Centrifuge 5810R
Plate Reader Molecular Device SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer
Incubator Thermo Fisher Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees
Shaker Incubator New Brunswick
Water Bath Thermo Fisher IsoTemp 205
Puncher
50 ml Falocn BD Falcon
Beaker Nalgene
Flask Nalgene
Petriplates (150mm) Greiner bio-one

Referências

  1. Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
  2. Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
  3. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  4. Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  5. Gavin, A. -. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  6. Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
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  8. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
  9. Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
  10. Klein, P., Dietz, K. -. J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
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Citar este artigo
Tripathi, P., Pruneda-Paz, J. L., Kay, S. A. A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies. J. Vis. Exp. (125), e56080, doi:10.3791/56080 (2017).

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