Summary

異種タンパク質複合体-DNA相互作用研究のための改変酵母1ハイブリッドシステム

Published: July 24, 2017
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Summary

本明細書に記載の改変酵母一ハイブリッドアッセイは、任意の機能的ゲノミクス研究のための異種系におけるヘテロメリックタンパク質複合体-DNA相互作用を研究および検証するための古典的酵母一ハイブリッド(Y1H)アッセイの延長である。

Abstract

長年にわたって、酵母1ハイブリッドアッセイは、転写因子(TF)およびそれらのDNA標的などのタンパク質間の物理的相互作用の同定および確認のための重要な技術であることが証明されている。本明細書中に提示される方法は、Y1Hの基本概念を利用するが、標的DNAに結合するタンパク質複合体を研究し、検証するためにさらに修飾される。したがって、これは、改変酵母一ハイブリッド(Y1.5H)アッセイと呼ばれる。このアッセイは費用対効果が高く、通常の実験室環境で簡単に実施できます。異種システムを使用してもかかわらず 、記載された方法は、試験の任意のシステムで機能的ゲノミクス、特に植物ゲノミクスのためのそれらのDNA標的(単数または複数)に結合するヘテロメリックタンパク質複合体をテストし検証するための貴重なツールであり得ます。

Introduction

一般に、タンパク質-DNA相互作用を理解するために、Y1Hアッセイは実験室環境でうまく使用される好ましいシステムである1 。基本的なY1Hアッセイは、2つの成分を含む:a)レポータータンパク質をコードする遺伝子の上流に首尾よくクローニングされた目的のDNAを有するレポーター構築物; b)目的のTFと酵母転写活性化ドメイン(AD)との間に融合タンパク質を生成する発現構築物。目的のDNAは一般に「餌」と呼ばれ、融合タンパク質は「獲物」として知られている。過去数年間に、Y1Hアッセイの複数のバージョンが、独自の利点を備えた特定のニーズに合わせて開発されました2 。既存のY1Hアッセイは、一度に1つのタンパク質のDNAベイトとの相互作用を同定および確認するために首尾よく実施することができるが、ヘテロ二量体または多量体タンパク質-DNA相互作用を同定する能力は欠如している。

このアッセイの目的は、目的のタンパク質を活性化ドメイン(pDEST22:配列番号2)で発現させることであり、これは、標的DNA配列に結合する複数のタンパク質を同時に研究することを可能にする既存のY1Hの改変版である。 TF)と接触させ、酵母系において相互作用するタンパク質パートナー(pDEST32ΔDBD-TF)の存在下および/または非存在下でレポーターに融合した候補DNA領域の活性化を評価する。タンパク質は、標的の活性化のために必要とされる。これは、GATEWAYクローニング適合システムであり、従って、通常の実験室内で使用することが可能である。したがって、 インビトロでの分子および機能検証のためのそれらの可能なDNA標的に結合するタンパク質複合体を確認することは有利な戦略であるまたは任意のシステム。このようなタンデムアフィニティ精製などの現在の技術は、(TAP)の方法は高価であり、労働集約的であるが、大規模な3、4、5にタンパク質hetrocomplexesの検出を可能にします。この改変された酵母一ハイブリッドは、小規模の定期的な研究室で成功裏に実施することができ( 図1 )、費用対効果も高い。 Y1.5Hアッセイは、異種系を用いて共通のDNA標的に結合する多量体タンパク質複合体の役割を定義するという仮説を検証し検証するために、共同体全体の研究者を容易にすることができる。この知見に基づいて、この仮説は、好ましい研究系においてインビボで検証され得る 。最近、我々は、シロイヌナズナ6における開花を調節するためのTFの役割およびその作用様式を定義するためにこのアプローチを使用した6

Protocol

1.構築およびレポータープラスミドの調製 大腸菌 (TOP10)を用いて、エントリーベクターへのさらなるクローニングのために分析される標的DNAのプロモーター領域/「フラグメント」(好ましくは約250〜500bp)をPCR増幅する。 以前8、9、10、11に記載のよ?…

Representative Results

関心対象のタンパク質を含む酵母細胞におけるDNA領域の同時形質転換のための一般的なプレートセットアップ手順( 図2 )。プレートのセットアップは、実験の必要性および試験されたDNA領域/フラグメントの数に従って改変することができる。プロトコールの5日後、よく増殖し陽性のプレートは図3のように見えるはずで?…

Discussion

既存のY1H標準手順は、そのDNA餌に結合する単一のタンパク質餌を同定するのに適している。種々の技術的改変により、既存のシステムは転写調節ネットワークを規定するために利用されている。しかし、TFは、2つ以上のTFまたはタンパク質を含む複合体の一部として機能することが知られており、TFの一部のみがDNAに結合することができる。タンパク質結合ドメインのみを有し、DNAに結合する…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SS Wang、M. Amar、A. Gallaに原稿の批評を読んだことに感謝します。この刊行物で報告された研究は、受賞番号RO1GM067837およびRO1GM056006(SAKへ)の下、国立衛生研究所の国立総合医療研究所によって支持された。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

Materials

pDEST22 vector Invitrogen PQ1000101 Pro-Quest Two hybrid system kit
pDEST32delatDBD Invitrogen PQ1000102 Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Invitrogen K240020
YM4271 Strain Clontech K1603-1 MATCHMAKER One-Hybrid System
pEXP-AD502 Invitrogen PQ1000101 Pro-Quest Two hybrid system kit
GATEWAY LR Clonase II enzyme mix Invitrogen 11791020
YPDA media Clontech 630410
SD-Agar Clontech 630412
SD minimal media Clontech 630411
Uracil DO Supplement Clontech 630416
Tryptophan Do Supplement Clontech 630413
Tris Base Fisher Scientific BP152-1
EDTA Fisher Scientific S311-500
LiAc Sigma-Aldrich L4158
Saplmon Sperm (10mg/ml) Invitrogen 15632011
96 well round bottom Plate Greiner bio-one 650101
PEG3350 Sigma-Aldrich 1546547
96-deep well block USA Scientific 1896-2000
Sealable Foil USA Scientific 2923-0110
Araseal Excel Scientific B-100
2-mercaptoethanol Fisher Scientific 034461-100
ONPG Sigma-Aldrich 73660
Na2CO3 Sigma-Aldrich 223484
Na2HPO4  Sigma-Aldrich S3264
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S3139
KCL Fisher Scientific BP366-500
MgSO4  Sigma-Aldrich 83266
HCL Fisher Scientific SA54-4
Drybath Thermo Fischer
Voretx Thermo Fischer
Centrifgue Eppendorf Centrifuge 5810R
Plate Reader Molecular Device SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer
Incubator Thermo Fisher Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees
Shaker Incubator New Brunswick
Water Bath Thermo Fisher IsoTemp 205
Puncher
50 ml Falocn BD Falcon
Beaker Nalgene
Flask Nalgene
Petriplates (150mm) Greiner bio-one

Referências

  1. Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
  2. Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
  3. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  4. Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  5. Gavin, A. -. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
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  7. Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
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  10. Klein, P., Dietz, K. -. J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
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Citar este artigo
Tripathi, P., Pruneda-Paz, J. L., Kay, S. A. A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies. J. Vis. Exp. (125), e56080, doi:10.3791/56080 (2017).

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