RNA에 의한 Locust Antenna 내의 악취 수용체 유전자의 국산화<em> 현장에서</em> 하이브리드 화
Summary
이 논문은 digoxigenin (DIG) 표지 또는 바이오틴 표지 프로브를 사용하는 곤충 안테나에서 특히 낮은 수준으로 발현 된 Odorant Receptor (OR) 유전자 및 기타 유전자에 대해 상세하고 매우 효과적인 RNA in situ hybridization 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
곤충은 외인성 화학 신호를 감지하기 위해 정교한 후각 수용체 시스템을 발전 시켰습니다. 이 화학적 신호는 안테나의 chemosensilla라고 불리는 모발 모양의 구조물에 수용된 후각 수용체 뉴런 (ORN)에 의해 전달됩니다. ORN의 멤브레인에서 악취 수용체 (OR)는 악취 코딩에 관여한다고 여겨집니다. 따라서, ORN에 국한 된 유전자를 동정 할 수있는 것은 OR 유전자를 인식하는 데 필요하며, 기능적 현장 연구 에 대한 근본적인 기초를 제공한다. 곤충 안테나에서 특정 OR 의 RNA 발현 수준은 매우 낮으며 조직학을 위해 곤충 조직을 보존하는 것은 어렵습니다. 따라서, RNA in situ hybridization을 사용하여 특정 종류의 감각 기관에 OR을 위치시키는 것은 어렵습니다. 이 논문에서는 특히 곤충의 저 발현 OR 유전자에 대한 상세하고 매우 효과적인 RNA in situ hybridization protocol을 소개한다. 또한 특정 OR 유전자 WAOrco 를 표지자로 사용하여 이중 형광 형광 in situ 하이브리드 화 실험을 수행함으로써 확인되었다.
Introduction
가장 중요한 화학 감각 기관인 곤충 안테나는 후각 수용체 뉴런 (ORN)에 의해 자극되는 많은 모발 모양의 구조 (sensilla라고 불리는)로 덮여 있습니다. 곤충 ORN의 멤브레인에서 7 개의 막 횡단 도메인을 포함하는 유형의 악취 수용체 (OR)는 보조 수용체 (ORco)로 발현되어 냄새 유발 이온 채널 1 , 2 , 3의 기능을하는 이종 체를 형성합니다. 다른 OR는 화합물 4 , 5 , 6 의 다양한 조합에 반응합니다.
메뚜기는 (로커 스타 migratoria)을 중심으로 중요한 행동 7을 실행하는 데 후각 단서에 의존하고 있습니다. 로커스트 OR는 분자 후각 메커니즘을 이해하는 핵심 요소입니다. 특정 메뚜기 또는 유전자를 a의 뉴런으로 국한시키기RNA에 의한 형태 학적으로 특이한 sensillum type In situ hybridization (RNA ISH)은 ORs 기능을 탐색하는 첫 번째 단계입니다.
RNA ISH는 생리 학적 과정 및 질환 발병 기전에 대한 통찰력을 제공 측정 조직, 세포 또는 시츄 전체 마운트 부에 특정 RNA 서열 현지화 표지 된 상보적인 RNA 프로브를 사용한다. Digoxigenin-labeled (DIG-labeled) 및 biotin-labeled RNA 프로브는 RNA 하이브리드 화에 널리 사용되었습니다. digoxigenin-11-UTP 또는 biotin-16-UTP를 이용한 RNA 표지는 SP6 및 T7 RNA 중합 효소를 사용하여 in vitro 전사에 의해 준비 할 수 있습니다. DIG 및 비오틴 표지 RNA 프로브는 다음과 같은 장점이 있습니다. 비 방사성; 안전한; 안정된; 매우 민감한; 매우 구체적; PCR 및 시험관 전사를 사용하여 생산하기 쉽습니다. DIG 및 비오틴으로 표지 된 RNA 프로브는 발색 적 및 형광 검출이 가능합니다. DIG로 표지 된 RNA 프로브는 항 디곡시 제닌 알칼리로 검출 할 수 있습니다광학 현미경을 사용하여 또는 2 (NBT / BCIP)를 사용하여 매우 민감한 화학 발광 기질 nitroblue tetrazolium chloride / 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 – 인산 톨루이딘 염 (NBT / BCIP)으로 시각화 할 수있는 Phosphatase (HNPP)와 4- 클로로 -2- 메틸 벤젠 디아 조늄 헤미 – 아연 클로라이드 염 (Fast Red)을 커플 링 (confocal) 현미경을 사용하여 커플 링시켰다. 비오틴 – 표지 RNA 프로브는 공 촛점 현미경을 사용하여 fluorescein-tyramides로 시각화 할 수있는 항 비오틴 streptavidin Horse Radish Peroxidase (HRP) – 결합 항체로 검출 할 수 있습니다. 따라서 이중 색 형광 in situ 하이브리드 화를 수행하여 DIG 및 비오틴으로 표지 된 RNA 프로브를 사용하여 한 조각에서 두 개의 표적 유전자를 검출 할 수 있습니다.
DIG 및 / 또는 바이오틴 표지 된 프로브를 사용한 RNA ISH는 OR , 이온 성 수용체, 악취 – 결합 단백질과 같은 후각 관련 유전자의 위치를 파악하는 데 성공적으로 사용되었습니다Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria 및 사막 메뚜기 Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16의 곤충 안테나에서의 감각 뉴런 막 단백질 그러나 곤충 OR에 RNA ISH를 수행 할 때 두 가지 중요한 문제가 있습니다 : (1) OR 유전자 ( ORco 제외)는 낮은 수준에서 소수의 세포에서만 발현되므로 신호 검출이 매우 어렵고 (2) 곤충 조직을 형태학이 보존되고 배경 소음이 낮아지는 조직학은 어려울 수 있습니다. 이 논문에서는 곤충에 OR 유전자를 국한시키기위한 RNA ISH를 기술하는 상세하고 효과적인 프로토콜(Chromogenic) 및 티라 미드 신호 증폭 (Tyramide Signal Amplification, TSA) 검출을 포함한 안테나가 제시된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
ORCO를 제외한 OR 유전자의 발현 수준이 매우 낮고 곤충 안테나의 조직 학적 조각을 보존하는 것이 매우 어렵 기 때문에 곤충 안테나에서 OR 유전자를 국소화하기 위해 RNA ISH를 수행하는 것은 어렵다. 또한 TSA 탐지 또한 매우 까다 롭습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 다음과 같은 조치를 취해야합니다. 안테나는 얇고 부드러운 촉각 촉모가있는 새로 태어난 성인 메뚜기에서 선택됩니다. ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단 (No.31472037)의 지원으로 지원됩니다. 이 기사의 상호 또는 상업 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공 할 목적으로 만 사용되었으며 권장 사항을 의미하지는 않습니다.
Materials
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12%acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5%NaCl |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14mM KH2PO4 |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80mM Na2HPO4 |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1M Tris-Base |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/ml yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/ml herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
Referências
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