Lokalisatie van Receptorgenen van Reukstof in Locustantenne door RNA<em> In situ</em> Hybridisatie
Summary
Dit document beschrijft een gedetailleerd en zeer effectief RNA in situ hybridisatie protocol, in het bijzonder voor lage-uitgedrukte Geurstof Receptor (OR) genen, evenals andere genen, in insectenantennen met behulp van digoxigenine (DIG) gelabeld of biotine gelabelde probes.
Abstract
Insecten hebben ontwikkelde geavanceerde olfactieve ontvangstsystemen ontwikkeld om exogene chemische signalen te detecteren. Deze chemische signalen worden getransduceerd door Olfactory Receptor Neurons (ORNs), gehuisvest in haarachtige structuren, genaamd chemosensilla, van de antennes. Op de membranen van de ORN's worden geurstofreceptoren (OR's) geacht betrokken te zijn bij geurcodering. Zo kunnen genen die gelokaliseerd zijn aan de ORN's identificeren, noodzakelijk zijn om OR genen te herkennen en een fundamentele basis voor verdere functionele in situ studies. De RNA-expressieniveaus van specifieke OR 's in insectenantennen zijn zeer laag, en het behoud van insectenweefsel voor histologie is uitdagend. Zo is het moeilijk om een OR aan een specifiek type sensilla te lokaliseren met behulp van RNA in situ hybridisatie. In dit document wordt een gedetailleerd en zeer effectief RNA in situ hybridisatie protocol in het bijzonder voor lowly uitgedrukt OR genen van insecten geïntroduceerd. Daarnaast is een specifieke OR Gen waS geïdentificeerd door het uitvoeren van dubbele kleur fluorescerende in situ hybridisatie experimenten onder gebruikmaking van een co-expressie receptor-gen, Orco , als een marker.
Introduction
Insectantenne, die de belangrijkste chemosensorische organen zijn, zijn bedekt met veel haarachtige structuren – genaamd sensilla – die door de Olfactor Receptor Neurons (ORNs) worden geïnvesteerd. Op het membraan van insecten ORN's, geurstofreceptoren (OR's), een type eiwit dat zeven transmembrane domeinen bevat, worden uitgedrukt met een coreceptor (ORco) om een heteromeer te vormen dat fungeert als een geurstofgated ion-kanaal 1 , 2 , 3 . Verschillende OR's reageren op verschillende combinaties van chemische verbindingen 4 , 5 , 6 .
Sprinkhanen ( Locusta migratoria ) vertrouwen voornamelijk op olfactische signalen om belangrijke gedragingen te veroorzaken 7 . Locust ORs zijn belangrijke factoren voor het begrijpen van moleculaire olfactorische mechanismen. Lokeren van een specifiek sprinkaan OR-gen voor de neuron van aMorfologisch specifiek sensillum type door RNA In Situ Hybridization (RNA ISH) is de eerste stap in het verkennen van de ORs functie.
RNA ISH maakt gebruik van een gelabelde complementaire RNA-probe om een specifieke RNA-sequentie in een gedeelte van weefsel, cellen of hele mounts in situ te meten en lokaliseren, die inzicht geeft in fysiologische processen en pathogenese van ziekten. Digoxigenine-gelabelde (DIG-gemarkeerde) en biotine-gelabelde RNA probes zijn wijd gebruikt in RNA hybridisatie. RNA-etikettering met digoxigenine-11-UTP of biotine-16-UTP kan worden bereid door in vitro transcriptie met SP6 en T7 RNA polymerasen. DIG- en biotine-gelabelde RNA probes hebben de volgende voordelen: niet-radioactief; veilig; stal; hoog sensitief; Zeer specifiek; En makkelijk te produceren met behulp van PCR en in vitro transcriptie. DIG- en biotine-gelabelde RNA-probes kunnen chromogeen en fluorescentief gedetecteerd worden. DIG-gemerkte RNA probes kunnen worden gedetecteerd met anti-digoxigenin AlkaliNe-fosfatase (AP) geconjugeerde antilichamen die kunnen worden aangetoond met het zeer gevoelige chemiluminescerende substraten nitroblue tetrazoliumchloride / 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat toluidine zout (NBT / BCIP) met behulp van een optische microscoop of met 2 -hydroxy-3-naftoïnezuur-2'-fenylanilidefosfaat (HNPP) gekoppeld met 4-chloor-2-methylbenzeendiediazonium hemi-zinkchloridezout (Fast Red) onder gebruikmaking van een confocale microscoop. Biotine-gemarkeerde RNA probes kunnen worden gedetecteerd met anti-biotine streptavidine Horse Radish Peroxidase (HRP) geconjugeerde antilichamen die kunnen worden gevisualiseerd met fluoresceïne-tyramiden met behulp van een confocale microscoop. Zo kan dubbele kleur fluorescerende in situ hybridisatie worden uitgevoerd om twee doelgenen in één segment te detecteren met gebruikmaking van DIG- en biotine-gemarkeerde RNA probes.
RNA ISH met DIG- en / of biotine-gemarkeerde probes is succesvol gebruikt om olfactorische gerelateerde genen te lokaliseren, zoals OR , ionotrope receptor, reukstofbindend eiwitEn sensorisch neuron membraan eiwit, in insectenantennen van, maar niet beperkt tot, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria en de woestijn sprinkaan Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Er zijn echter twee belangrijke uitdagingen bij het uitvoeren van RNA ISH voor insecten ORs: (1) OF genen (behalve ORco ) worden op lage niveaus uitgedrukt en slechts in een paar cellen, waardoor detectie van het signaal erg moeilijk is, en (2) het behoud van insectenweefsel voor Histologie, zodanig dat de morfologie behouden blijft en de achtergrondgeluid laag is, kan uitdagend zijn. In dit artikel een gedetailleerd en effectief protocol dat RNA ISH beschrijft voor het lokaliseren van OR genen in insectenAntennes worden gepresenteerd, inclusief zowel chromogene als Tyramide Signal Amplification (TSA) detectie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is moeilijk om RNA ISH uit te voeren om OR genen in insectenantennen te lokaliseren, omdat de expressieniveaus van OR-genen, behalve ORco , zeer laag zijn en het behoud van histologische plakjes insectenantenne zeer moeilijk is. Bovendien is TSA detectie ook erg lastig. Om deze problemen aan te pakken, dienen de volgende maatregelen te worden genomen. De antennes worden geselecteerd uit nieuwsmoltende sprinkhanen met dunne en zachte antennaleikels, die hun morfologie op de glijbaan handhaven. De bevroren mo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (nr.31472037). Het vermelden van handelsnamen of handelsproducten in dit artikel is uitsluitend bedoeld om specifieke informatie te verstrekken en houdt geen aanbeveling in.
Materials
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12%acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5%NaCl |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14mM KH2PO4 |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80mM Na2HPO4 |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1M Tris-Base |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/ml yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/ml herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
Referências
- Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
- Smart, R., et al. Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).
- Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).
- Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).
- Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes. Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).
- Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
- Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern. Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).
- Schultze, A., et al. The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae. PLoS One. 8 (7), e69412 (2013).
- Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria). BMC Neurosci. 14, 50 (2013).
- Saina, M., Benton, R. Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila. Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).
- Guo, M., Krieger, J., Große-Wilde, E., Mißbach, C., Zhang, L., Breer, H. Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria). Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).
- You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria. Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).
- Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. Identification and characterization of two “Sensory Neuron Membrane Proteins” (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae). J Insect Sci. 16 (1), 33 (2016).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C., Wilkinson, D. G. In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes. In situ hybridization. , 2 (1992).
- Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate. Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).
- Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117 (7), 965-979 (2004).
- Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution. Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).
