Localizzazione dei geni del recettore degli odoranti nell'antenna di Locust da RNA<em> In Situ</em> Ibridazione
Summary
Questo articolo descrive un protocollo dettagliato e altamente efficace di ibridazione de RNA in situ , in particolare per i geni espressi a basso livello del recettore dell'Odorant (OR), così come altri geni, nelle antenne degli insetti utilizzando digoxigenina (DIG) o sonde con biotina.
Abstract
Gli insetti hanno evoluto sofisticati sistemi di accoglienza olfattiva per sensibilizzare i segnali chimici esogeni. Questi segnali chimici sono trasdolati da Neuroni Receptor Olfattivi (ORNs) alloggiati in strutture di capelli, chiamate chemosensilla, delle antenne. Nelle membrane delle ORN, si ritiene che i recettori ordoranti (OR) siano coinvolti nella codifica degli odori. Quindi, essere in grado di identificare i geni localizzati alle ORN è necessario per riconoscere i geni OR e costituisce una base fondamentale per ulteriori studi funzionali in situ . I livelli di espressione di RNA di OR specifici nelle antenne insettici sono molto basse e la conservazione del tessuto degli insetti per l'istologia è impegnativa. Pertanto, è difficile localizzare un OR ad un tipo specifico di sensilla usando l'ibridazione RNA in situ . In questo articolo viene introdotto un protocollo dettagliato e altamente efficace di RNA in situ di ibridazione in particolare per i geni OR insoddisfatti di espressione debole. Inoltre, uno specifico OR Gene waS identificata condurre esperimenti di ibridazione in situ fluorescenti a doppio colore usando un gene recettore co-esprimente, Orco , come marker.
Introduction
Le antenne degli insetti, che sono gli organi chemo-senoriali più importanti, sono ricoperti da molte strutture del capello, chiamate sensilla, che sono innervate dai neuroni dell'orecchio olfattivo (ORN). Sulla membrana degli ORN insetti, i recettori ordoranti (OR), un tipo di proteina contenente sette domini transmembranti, vengono espressi con un coreceptore (ORco) per formare un eteromero che funge da canale ionico 1 , 2 , 3 . ORs differenti rispondono a diverse combinazioni di composti chimici 4 , 5 , 6 .
Le locuste ( Locusta migratoria ) si basano principalmente sulle indicazioni olfattive per attivare comportamenti importanti 7 . Gli OR Locust sono fattori chiave per comprendere i meccanismi olfattivi molecolari. Localizzare una specifica locusta OR gene al neurone di aTipo sensilismo morfologicamente specifico da RNA In Hybridization In Situ (RNA ISH) è il primo passo per esplorare la funzione OR.
RNA ISH utilizza una sonda RNA complementare etichettata per misurare e localizzare una sequenza specifica di RNA in sezione di tessuti, cellule o montanti interi in situ , fornendo approfondimenti nei processi fisiologici e nella patogenesi della malattia. Sono state ampiamente utilizzate sonde RNA con etichettatura digossigenina (DIG-etichettata) e biotina. L'etichettatura di RNA con digoxigenina-11-UTP o biotina-16-UTP può essere preparata mediante trascrizione in vitro con le polimerasi RNA di SP6 e T7. Le sonde RNA con DIG e biotina hanno i seguenti vantaggi: non radioattivi; sicuro; stabile; Altamente sensibile; Altamente specifiche; E facile da produrre usando PCR e trascrizione in vitro . Le sonde RNA con DIG e biotina possono essere rilevate in modo cromogeno e fluorescente. Le sonde RNA con etichetta DIG possono essere rilevate con anti-digoxigenin AlkaliNe anticorpi concomitanti con fosfatasi (AP) che possono essere visualizzati con substrati chemiluminescenti altamente sensibili nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato toluidina (NBT / BCIP) utilizzando un microscopio ottico o con 2 Acido-2-fenilanilide fosfato (HNPP) accoppiato con sale di cloruro di emiciclo 4-chloro-2-methylbenzenediazonium (Fast Red) utilizzando un microscopio confocale. Le sonde RNA con biotina possono essere rilevate con anticorpi coniugati con anti-biotina streptavidina per rade di rapa perossidasi (HRP) che possono essere visualizzati con tiramidi di fluoresceina usando un microscopio confocale. Così, l'ibridazione in situ fluorescente a doppio colore può essere eseguita per rilevare due geni bersaglio in una fetta usando sonde RNA etichette DIG e biotina.
RNA ISH con sonde DIG e / o biotina è stato utilizzato con successo per localizzare i geni correlati agli olfattivi, come OR , recettore ionotropico, proteina legante odoranteE proteine della membrana del neurone sensoriale, nelle antenne insettuali di, ma non solo, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria e la locusta di deserto Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Tuttavia, ci sono due sfide sostanziali quando si esegue RNA ISH per gli OR di insetti: (1) OR geni (ad eccezione di ORco ) sono espressi a bassi livelli e solo in poche cellule, rendendo molto rilevante il rilevamento del segnale e (2) Istologia, tale che la morfologia sia preservata e il rumore di fondo è basso, può essere impegnativo. In questo documento un protocollo dettagliato ed efficace che descrive RNA ISH per localizzare i geni OR in insettoVengono presentate antenne, tra cui sia la rilevazione cromatica e la tastatura del segnale di tiramide (TSA).
Protocol
Representative Results
Discussion
È difficile eseguire RNA ISH per localizzare i geni OR nelle antenne degli insetti perché i livelli di espressione di geni OR, ad eccezione di ORco , sono molto bassi e che preservano fette istologiche di antenne insettiche è molto difficile. Inoltre, il rilevamento di TSA è anche molto complicato. Per risolvere questi problemi, occorre prendere le seguenti misure. Le antenne sono scelte da locuzioni adulte di recente molting che presentano cuticole sottili e morbide di antenne, che mantengono la loro morfo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato da una sovvenzione della National Natural Science Foundation della Cina (No.31472037). La menzione dei nomi commerciali o dei prodotti commerciali in questo articolo è esclusivamente ai fini di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazioni.
Materials
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12%acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5%NaCl |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14mM KH2PO4 |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80mM Na2HPO4 |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1M Tris-Base |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/ml yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/ml herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
Referências
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