Локализация генов-рецепторов одоранта в аутоантителе с помощью РНК<em> Разное</em> Гибридизация
Summary
В этой статье описывается подробный и высокоэффективный протокол гибридизации РНК de situ, в частности, для низкоуровневых экспрессированных генов одорантного рецептора (OR), а также других генов у антенн насекомых с использованием меток дигоксигенина (DIG) или меченых биотином.
Abstract
Насекомые развили сложные системы обонятельного приема, чтобы ощущать экзогенные химические сигналы. Эти химические сигналы трансдуцируются ольфакторными рецепторными нейронами (ORN), расположенными в волоскоподобных структурах, называемых хемосензиллами антенн. На мембранах ORNs, считается, что рецепторы одорантов (ORs) участвуют в кодировании запаха. Таким образом, способность идентифицировать гены, локализованные в ORN, необходима для распознавания OR генов и обеспечивает фундаментальную основу для дальнейших функциональных исследований in situ . Уровни экспрессии РНК специфических OR s в антеннах насекомых очень низки, а сохранение ткани насекомых для гистологии является сложной задачей. Таким образом, трудно локализовать OR на определенный тип сенсиллы, используя гибридизацию РНК de situ. В этой статье вводится подробный и высокоэффективный протокол гибридизации РНК de situ, особенно для слабо выраженных OR генов насекомых. Кроме того, конкретный OR Ген ваИдентифицированных путем проведения двухцветных флуоресцентных экспериментов по гибридизации de situ с использованием ко-экспрессирующего рецепторного гена Orco в качестве маркера.
Introduction
Насекомые-антенны, которые являются наиболее важными хемосенсорными органами, покрыты многими волоскоподобными структурами, называемыми сенсиллами, которые иннервируются обонятельными рецепторными нейронами (ОРН). На мембране ORN насекомых рецепторы одорантов (ORs), тип белка, содержащего семь трансмембранных доменов, экспрессируются с помощью корецептора (ORco) с образованием гетеромера, который функционирует как ионный канал 1 , 2 , 3 с одорантом. Различные ОР реагируют на различные комбинации химических соединений 4 , 5 , 6 .
Саранча ( Locusta migratoria ) в основном полагается на обонятельные сигналы, чтобы вызвать важные формы поведения 7 . Осколки саранчи являются ключевыми факторами для понимания механизмов молекулярного обоняния. Локализация определенного гена ORG саранчи к нейронуМорфологически специфический тип сенсиллиума с помощью РНК In Situ Hybridization (RNA ISH) является первым шагом в изучении функции ORs.
РНК ISH использует меченый комплементарный зонд РНК для измерения и локализации специфической последовательности РНК в секции ткани, клеток или целых опор на месте , обеспечивая понимание физиологических процессов и патогенеза болезни. Меченые дигоксигенином (DIG-меченые) и меченные биотином РНК-зонды широко использовались при гибридизации РНК. РНК-маркировка дигоксигенином-11-UTP или биотин-16-UTP может быть получена путем транскрипции in vitro с помощью РНК-полимераз SP6 и T7. DIG- и биотин-меченные РНК-зонды имеют следующие преимущества: нерадиоактивные; безопасно; стабильная; Высокочувствительный; Высокоспециализированный; И легко производить с использованием ПЦР и транскрипции in vitro . DIG- и биотин-меченные РНК-зонды могут быть хромогенными и флуоресцентными. DIG-меченые РНК-зонды могут быть обнаружены с помощью анти-дигоксигенина щелочиNe Phosphatase (AP) -конъюгированные антитела, которые могут быть визуализированы либо с помощью высокочувствительных хемилюминесцентных субстратов нитроилтетразолия хлорида / 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата толуидиновой соли (NBT / BCIP) с использованием оптического микроскопа или с 2 -гидрокси-3-нафтойной кислоты-2'-фениланилидфосфата (HNPP) в сочетании с хлоридом хлорида 4-хлор-2-метилбензолдиазония (Fast Red) с использованием конфокального микроскопа. Меченые биотином РНК-зонды могут быть обнаружены с анти-биотин-стрептавидином конъюгированной пероксидазой (HRP) -конъюгированными антителами, которые можно визуализировать с помощью флуоресцеин-тирамидов с использованием конфокального микроскопа. Таким образом, двухцветная флуоресцентная гибридизация de situ может быть выполнена для обнаружения двух генов-мишеней в одном срезе с использованием меченых DIG- и биотином РНК-зондов.
РНК ISH с DIG- и / или биотин-мечеными зондами успешно используется для локализации генов, связанных с обонятельной способностью, таких как OR , ионотропный рецептор, связывающий одорант белокИ мембранного белка сенсорной нейроны, в насекомых-антеннах, но не ограничиваясь ими, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria и пустынной саранчи Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Однако при выполнении РНК ISH для ORS насекомых существуют две существенные проблемы: (1) OR гены (кроме ORco ) выражены на низких уровнях и только в нескольких клетках, что затрудняет обнаружение сигнала и (2) сохранение ткани насекомых для Гистологии, так что морфология сохраняется и фоновый шум является низким, может быть сложным. В этой статье представлен подробный и эффективный протокол, описывающий РНК ISH для локализации генов OR у насекомыхПредставлены антенны, в том числе обнаружение хромогенного и тирамидного сигналов (TSA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Трудно выполнить РНК ISH локализовать OR гены в антеннах насекомых, потому что уровни экспрессии генов OR, за исключением ORco , очень низки, и сохранение гистологических фрагментов антенн насекомых очень сложно. Кроме того, обнаружение TSA также очень сложно. Для решения этих проблем нео…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается грантом Национального фонда естественных наук Китая (No.31472037). Упоминание торговых наименований или коммерческих продуктов в этой статье предназначено исключительно для целей предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации.
Materials
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12%acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5%NaCl |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14mM KH2PO4 |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80mM Na2HPO4 |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1M Tris-Base |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/ml yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/ml herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
Referências
- Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
- Smart, R., et al. Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).
- Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).
- Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).
- Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes. Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).
- Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
- Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern. Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).
- Schultze, A., et al. The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae. PLoS One. 8 (7), e69412 (2013).
- Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria). BMC Neurosci. 14, 50 (2013).
- Saina, M., Benton, R. Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila. Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).
- Guo, M., Krieger, J., Große-Wilde, E., Mißbach, C., Zhang, L., Breer, H. Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria). Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).
- You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria. Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).
- Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. Identification and characterization of two “Sensory Neuron Membrane Proteins” (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae). J Insect Sci. 16 (1), 33 (2016).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C., Wilkinson, D. G. In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes. In situ hybridization. , 2 (1992).
- Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate. Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).
- Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117 (7), 965-979 (2004).
- Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution. Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).
