Localização de Genes de Receptor de Odorantes em Antenas de Locustídeo por RNA<em> In Situ</em> Hibridação
Summary
Este artigo descreve um protocolo de hibridação in situ ARN detalhado e altamente eficaz, particularmente para genes de receptores de odorantes (OR) de baixo nível, bem como outros genes, em antenas de insetos usando sondas marcadas com digoxigenina (DIG) ou marcadas com biotina.
Abstract
Os insetos evoluíram sofisticados sistemas de recepção olfativa para detectar sinais químicos exógenos. Esses sinais químicos são transduzidos por neurônios receptores olfatórios (ORNs) alojados em estruturas parecidas com o cabelo, chamados de quimiosensila, das antenas. Nas membranas dos ORN, pensa-se que os receptores de odorantes (RUP) estão envolvidos na codificação de odor. Assim, ser capaz de identificar genes localizados nas ORNs é necessário reconhecer genes OR e fornece uma base fundamental para novos estudos funcionais in situ . Os níveis de expressão de RNA de OR específicos em antenas de insetos são muito baixos e a preservação do tecido de insetos para a histologia é desafiadora. Assim, é difícil localizar um OR para um tipo específico de sensilla usando hibridização in situ RNA. Neste artigo, é introduzido um protocolo de hibridação in situ ARN detalhado e altamente eficaz, particularmente para genes OR de insetos pequenos. Além disso, um OR específico Gene waS identificado pela realização de experiências de hibridação in situ fluorescentes de duas cores utilizando um gene de receptor coexpressivo , Orco , como marcador.
Introduction
As antenas de insetos, que são os órgãos quimiossensores mais importantes, são cobertas com muitas estruturas parecidas com o cabelo – chamadas sensilla – que são inervadas pelos neurônios receptores olfatórios (ORNs). Na membrana de ORN de insetos, os receptores de odorantes (OR), um tipo de proteína contendo sete domínios transmembranares, são expressos com um coreceptor (ORco) para formar um heterômero que funciona como um canal iónico 1 , 2 , 3 odorante. OUs diferentes respondem a diferentes combinações de compostos químicos 4 , 5 , 6 .
Os gafanhotos ( Locusta migratoria ) dependem principalmente de pistas olfativas para desencadear comportamentos importantes 7 . As ERs do Locustão são fatores-chave para a compreensão dos mecanismos olfativos moleculares. Localizando um gene OR específico para o neurônio de umO tipo de sensibilidade morfológicamente específico por ARN In Situ Hybridization (RNA ISH) é o primeiro passo na exploração da função OR.
RNA ISH usa uma sonda de ARN complementar marcada para medir e localizar uma sequência de ARN específica em uma seção de tecido, células ou montagens inteiras in situ , fornecendo informações sobre processos fisiológicos e patogênese da doença. As sondas de ARN marcadas com marcadores de digoxigenina (marcados com DIG) e de biotina foram amplamente utilizadas na hibridação de ARN. A marcação de ARN com digoxigenina-11-UTP ou biotina-16-UTP pode ser preparada por transcrição in vitro com polimerases de ARN de SP6 e T7. As sondas de ARN marcadas com DIG e biotina possuem as seguintes vantagens: não radioativas; seguro; estável; altamente sensível; Altamente específico; E fácil de produzir usando PCR e transcrição in vitro . As sondas de ARN marcadas com DIG e biotina podem ser detectadas cromogenicamente e fluorescentemente. As sondas de ARN marcadas com DIG podem ser detectadas com Alkali anti-digoxigeninaAnticorpos conjugados com fosfatase (AP) que podem ser visualizados quer com os substratos quimioluminescentes altamente sensíveis cloreto de tetrazólio nitroblue / sal de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato toluidina (NBT / BCIP) utilizando um microscópio óptico ou com 2 -hidroxi-3-naftoico-2'-fenilanilida fosfato (HNPP) acoplado com sal de cloreto de hemi-zinco de 4-cloro-2-metilbenzenodiazónio (Fast Red) utilizando um microscópio confocal. As sondas de ARN marcadas com biotina podem ser detectadas com anticorpos conjugados anti-biotina com estreptavidina de rabo cavalo (HRP) que podem ser visualizados com fluoresceína-tiramides usando um microscópio confocal. Assim, a hibridação fluorescente in situ de duas cores pode ser realizada para detectar dois genes alvo em uma fatia usando sondas de RNA marcadas com DIG e biotina.
O RNA ISH com sondas marcadas com DIG e / ou biotina foi utilizado com sucesso para localizar genes relacionados ao olfato, tais como OR , receptor ionotrópico, proteína de ligação aos odorantesE proteína da membrana neuronal sensorial, em antenas de insetos de, entre outras, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria e gafanhoto do deserto, Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . No entanto, existem dois desafios substanciais ao executar RNA ISH para insetos OR: (1) OU genes (exceto ORco ) são expressos em níveis baixos e somente em algumas células, tornando a detecção de sinal muito difícil e (2) preservando o tecido de insetos para Histologia, de modo que a morfologia seja preservada e o ruído de fundo seja baixo, pode ser desafiador. Neste artigo, um protocolo detalhado e eficaz descrevendo RNA ISH para localizar genes OR em insetosAntenas são apresentadas, incluindo a detecção cromogênica e de ampliação de sinal de Tyramide (TSA).
Protocol
Representative Results
Discussion
É difícil realizar RNA ISH para localizar genes OU em antenas de insetos porque os níveis de expressão de genes OR, exceto ORco , são muito baixos e a preservação de fatias histológicas de antenas de insetos é muito difícil. Além disso, a detecção TSA também é muito complicada. Para resolver esses problemas, as seguintes medidas devem ser tomadas. As antenas são selecionadas a partir de gafas adultas de muda que possuem cutículas antenas finas e macias, que mantêm sua morfologia no slide. As a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado por uma doação da National Natural Science Foundation of China (nº31472037). A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais neste artigo é exclusivamente para fornecer informações específicas e não implica recomendação.
Materials
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12%acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5%NaCl |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14mM KH2PO4 |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80mM Na2HPO4 |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1M Tris-Base |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/ml yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/ml herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
Referências
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