आरएनए द्वारा टिड्ड एंटीना में गंधी रिसेप्टर जीन का स्थानीयकरण<em> क्षेत्र में</em> संकरण
Summary
इस पत्र में डिस्कोॉक्सिजेनिन (डीआईजी) -बेलेबेल्ड या बायोटिन-लेबल जांच के उपयोग से कीट एंटीना में, निम्न स्तर की ओर से गंधुर रिसेप्टर (या) जीनों के साथ-साथ अन्य जीनों के लिए स्वस्थानी संकरण प्रोटोकॉल में एक विस्तृत और अत्यधिक प्रभावी आरएनए का वर्णन किया गया है।
Abstract
कीटनाशकों ने एक्सोजेन्सिस के रासायनिक संकेतों को समझने के लिए परिष्कृत घ्राण रिसेप्शन सिस्टम विकसित किया है। इन रासायनिक संकेतों को एंटीना के केमोसेंसिया नामक बालों जैसे संरचनाओं में रखे ओल्फेन्टर रिसेप्टर न्यूरॉन्स (ओआरएन) द्वारा ट्रांसड्यूस किया जाता है। ORNs के झिल्ली पर, गंधक रिसेप्टर्स (ओआरएस) को गंध कोडिंग में शामिल माना जाता है। इस प्रकार, ORN को स्थानीयकरण करने वाले जीन की पहचान करने में सक्षम होने के लिए आवश्यक है या पहचानें या जीन, और सीटू स्टूड्स में आगे कार्यात्मक के लिए मौलिक आधार प्रदान करता है। कीट एंटीना में विशिष्ट ORs के आरएनए अभिव्यक्ति के स्तर बहुत कम हैं, और ऊतक विज्ञान के लिए कीट ऊतक के संरक्षण चुनौतीपूर्ण है। इस प्रकार, स्वस्थानी संकरण में आरएनए का उपयोग करके किसी विशिष्ट प्रकार की संवेदी को या तो स्थानीय या स्थानीय बनाना संभव है। इस पत्र में, स्वस्थानी संकरण प्रोटोकॉल में एक विस्तृत और अत्यधिक प्रभावी आरएनए विशेषकर नीच व्यक्त या कीड़ों के जीन को पेश किया जाता है। इसके अतिरिक्त, एक विशिष्ट या जीन वाएक मार्कर के रूप में एक सह-व्यक्त रिसेप्टर जीन, ओरको का उपयोग करते हुए स्वस्थानी संकरण प्रयोगों में दोहरे रंग के फ्लोरोसेंट का आयोजन करके पहचाना जाता है।
Introduction
कीट एंटीना, जो सबसे महत्वपूर्ण रसायनसूर्य अंग हैं, कई बाल-जैसे संरचनाओं से जुड़े होते हैं – जिन्हें संवेदी कहा जाता है – जो ओल्फेन्टर रिसेप्टर न्यूरॉन्स (ओआरएन) द्वारा उपयोग किया जाता है। कीट ORN के झिल्ली पर, odorant रिसेप्टर्स (ओआरएस), सात ट्रांसमैमब्रन डोमेन युक्त प्रोटीन का एक प्रकार एक कोरसिप्टर (ORCO) के साथ अभिव्यक्त किया जाता है, जो एक ऑटरोरर बनाने के लिए होता है जो एक गंधग्रस्त आयन चैनल 1 , 2 , 3 के रूप में कार्य करता है। अलग-अलग रासायनिक संयुग्म 4 , 5 , 6 के विभिन्न संयोजनों के अनुसार विभिन्न संगठनों का जवाब है।
टिड्डियां ( टिड्डुटा माइग्रेटोरिया ) मुख्य रूप से घृणित संवेदनाओं पर निर्भर करती है जो कि 7 के महत्वपूर्ण व्यवहार को ट्रिगर करती हैं। टिड्डी ओआरएस आणविक घ्राण तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं। एक विशिष्ट टिड्डी या जीन को न्यूरॉन में स्थानांतरित करनासीआरईए हाइब्रिडिजेशन (आरएनए आईएसएच) में आरएएन द्वारा आकृति विज्ञान के विशिष्ट संवेदी प्रकार ओआरएस फ़ंक्शन की खोज में पहला कदम है।
शाही सेना ईश को मापने और ऊतक, कोशिकाओं या सीटू पूरे माउंट की धारा में एक विशिष्ट शाही सेना अनुक्रम स्थानीय बनाना, शारीरिक प्रक्रियाओं और रोग रोगजनन में अंतर्दृष्टि प्रदान एक लेबल पूरक आरएनए जांच उपयोग करता है। डीएनजीआईजीनिन-लेबल (डीआईजी-लेबल) और बायोटिन-लेबल वाली आरएनए जांच का व्यापक रूप से आरएनए संकरण में उपयोग किया गया है। डीपीओसीजीनिन -11-यूटीपी या बायोटिन -16-यूटीपी के साथ आरएनए लेबलिंग इन विट्रो प्रतिलेखन में एसपी 6 और टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ के साथ तैयार किया जा सकता है। डीआईजी- और बायोटिन-लेबल वाले आरएनए जांच में निम्न लाभ हैं: गैर-रेडियोधर्मी; सुरक्षित; स्थिर; अत्यधिक संवेदनशील; अत्यधिक विशिष्ट; और पीसीआर और इन विट्रो प्रतिलेखन का उपयोग करना आसान है। डीआईजी- और बायोटिन लेबल वाला आरएनए जांच क्रोमोोजेनिक और फ्लोरोसेंट रूप से पता लगा सकते हैं। डीआईजी-लेबल वाली आरएनए जांचों का पता लगाया जा सकता है कि एंटी-डिगॉक्सिजेन अल्कली के साथनेफ फॉस्फेट (एपी) – संयुग्मित एंटीबॉडी जिन्हें ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप या 2 के साथ बेहद संवेदनशील रसायनयुक्त सब्ट्रेट्स नाइट्रोब्लेयू टेट्राज़ोलियम क्लोराइड / 5-ब्रोमो -4-क्लोरो-3-इंडोलिल-फॉस्फेट टोलुइडिन नमक (एनबीटी / बीसीआईपी) के साथ देखा जा सकता है 4-क्लोरो-2-मेथिलबेन्जेनियाज़ोनियम हेमी-जस्ता क्लोराइड नमक (फास्ट रेड) के साथ एक confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके -हाइड्रोक्सी-3-नाफ्टोलिक एसिड-2'-फेनिलाइलाइड फॉस्फेट (एचएनपीपी)। बायोटिन-लेबल वाली आरएनए जांचों से पता लगाया जा सकता है कि एंटी-बायोटिन स्ट्रेक्टिविडिन हार्स मूली पेरोक्साइड (एचआरपी) -कॉन्जुगेटेड एंटीबॉडी जो कि इन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फ्लोरोसिसिन-टाइरामाइड्स के साथ कल्पना की जा सकती हैं। इस प्रकार, डीआईजी और बायोटिन-लेबल वाली आरएनए जांचों का उपयोग करते हुए एक टुकड़ा में दो लक्ष्य जीनों का पता लगाने के लिए स्वस्थानी संकरण में दोहरे रंग का फ्लोरोसेंट किया जा सकता है।
डीआईजी और / या बायोटिन-लेबल वाले जांच के साथ आरएनए आईएसएच का उपयोग घ्राण-संबंधी जीनों को स्थानीय करने के लिए किया गया है, जैसे कि, या ionotropic रिसेप्टर, odorant-binding प्रोटीनऔर संवेदी न्यूरॉन झिल्ली प्रोटीन, के कीट एंटीना, लेकिन नहीं करने के लिए, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, एनोफ़ेलीज़ gambiae, एल migratoria और रेगिस्तान टिड्डी Schistocera gregaria 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 तक ही सीमित है। हालांकि, कीट ओआर के लिए आरएनए आईएसएच का प्रदर्शन करते समय दो महत्वपूर्ण चुनौतियां हैं: (1) या जीन ( ओआरसी को छोड़कर) कम स्तर पर और केवल कुछ कोशिकाओं में व्यक्त की जाती हैं, जिससे संकेत का पता लगाना बहुत मुश्किल होता है, और (2) कीट के ऊतकों को संरक्षित करने के लिए ऊतक विज्ञान, जैसे आकारिकी संरक्षित है और पृष्ठभूमि का शोर कम है, चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस पत्र में एक विस्तृत और प्रभावी प्रोटोकॉल आरटीए आईएसएच को स्थानीयकरण या कीट में जीन के लिए वर्णित करता हैएंटेना प्रस्तुत किया गया है, जिसमें क्रोमोजेनिक और टाइरामाइड सिग्नल एम्प्लीफिकेशन (टीएसए) दोनों का पता लगाया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कीट एंटीना में जीन या स्थानीयकरण करने के लिए आरएनए आईएसएच को करना मुश्किल है क्योंकि ओआरए को छोड़कर या जीन के अभिव्यक्ति के स्तर बहुत कम होते हैं और कीट एंटीना के हिस्टोलॉजिकल स्लाइस को संरक्षित क?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चीन के नेशनल नॅचुरल साइंस फाउंडेशन (नं। 1372037) से अनुदान द्वारा समर्थित है। इस लेख में व्यापारिक नाम या वाणिज्यिक उत्पादों का उल्लेख केवल विशिष्ट जानकारी प्रदान करने के उद्देश्य से है और सिफारिश नहीं करता है।
Materials
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12%acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5%NaCl |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14mM KH2PO4 |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80mM Na2HPO4 |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1M Tris-Base |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/ml yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/ml herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
Referências
- Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
- Smart, R., et al. Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).
- Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).
- Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).
- Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes. Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).
- Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
- Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern. Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).
- Schultze, A., et al. The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae. PLoS One. 8 (7), e69412 (2013).
- Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria). BMC Neurosci. 14, 50 (2013).
- Saina, M., Benton, R. Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila. Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).
- Guo, M., Krieger, J., Große-Wilde, E., Mißbach, C., Zhang, L., Breer, H. Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria). Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).
- You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria. Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).
- Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. Identification and characterization of two “Sensory Neuron Membrane Proteins” (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae). J Insect Sci. 16 (1), 33 (2016).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C., Wilkinson, D. G. In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes. In situ hybridization. , 2 (1992).
- Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate. Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).
- Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117 (7), 965-979 (2004).
- Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution. Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).
