Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung eines asymmetrischen Detektions-Zeitstreck-Optikmikroskopiesystems für die Einzelzell-Bildgebung in ultraschnellen mikrofluidischen Strömung und seine Anwendungen bei der Bildgebungsdurchflusszytometrie.
Die Skalierung der Anzahl der messbaren Parameter, die eine multidimensionale Datenanalyse und damit höhere statistische Konsequenzen ermöglicht, war der Haupttrend in der fortgeschrittenen Entwicklung der Durchflusszytometrie. Besonders das Hinzufügen hochauflösender Imaging-Fähigkeiten ermöglicht die komplexe morphologische Analyse von zellulären / subzellulären Strukturen. Dies ist bei Standard-Durchflusszytometern nicht möglich. Allerdings ist es wertvoll, unser Wissen über zelluläre Funktionen voranzubringen und kann der Life Science Forschung, der klinischen Diagnostik und der Umweltüberwachung zugute kommen. Die Einbindung von bildgebenden Fähigkeiten in die Durchflusszytometrie beeinträchtigt den Assay-Durchsatz, vor allem aufgrund der Einschränkungen der Geschwindigkeit und der Empfindlichkeit in den Kameratechnologien. Um diese Geschwindigkeits- oder Durchsatz-Herausforderung zu überwinden, die der bildgebenden Durchflusszytometrie unter Beibehaltung der Bildqualität entgegensteht, wurde die asymmetrische Erkennungszeit-Streck-Optikmikroskopie (ATOM) gezeigt, um ein kontrastreiches, einzelliges Individuum zu ermöglichenMit subzellulärer Auflösung, bei einem Bilddurchsatz bis zu 100.000 Zellen / s. Basierend auf dem bildgebenden Konzept der konventionellen Zeitstreck-Bildgebung, das durch die Verwendung von ultraschnellen Breitband-Laserpulsen auf die gesamte optische Bildcodierung und -abfrage beruht, führt ATOM die Bildgebungsleistung weiter, indem der Bildkontrast von unmarkierten / ungefärbten Zellen verbessert wird. Dies geschieht durch den Zugriff auf die Phasengradienteninformation der Zellen, die spektral in Einzelschuss-Breitbandimpulse codiert wird. Daher ist ATOM besonders vorteilhaft bei Hochdurchsatzmessungen von Einzelzellmorphologie und Textur – Information, die auf Zelltypen, Zustände und sogar Funktionen hindeutet. Letztendlich könnte dies zu einer leistungsfähigen bildgebenden Durchflusszytometrieplattform für die biophysikalische Phänotypisierung von Zellen werden, die den derzeitigen, auf dem Stand der Technik basierenden zellulären Test auf biochemischem Marker ergänzt. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Erstellung der Schlüsselmodule eines ATOM-Systems (vom optischen Frontend bis hin zu Daten pRüstungs- und Visualisierungs-Backend) sowie der Workflow der bildgebenden Durchflusszytometrie auf Basis von ATOM unter Verwendung menschlicher Zellen und Mikroalgen als Beispiele.
Die optische Bildgebung stellt ein leistungsstarkes Werkzeug und zellbasiertes Assay dar, um die detaillierte räumliche Verteilung vieler zellulärer / subzellulärer Komponenten (fast) nicht-invasiv zu visualisieren und so eine Vielzahl von morphologischen, biophysikalischen und biomolekularen Signaturen von Zellen aufzudecken. Allerdings wurde diese Fähigkeit, hochinhaltswerte Informationen aus einzelnen Zellen zu extrahieren, im Allgemeinen beeinträchtigt, als eine enorme und heterogene Population von Zellen untersucht werden musste. Dies markiert einen gemeinsamen Kompromiss in zellbasierten Assays zwischen Messdurchsatz und Inhalt. Ein bemerkenswertes Beispiel ist, dass das Hinzufügen von bildgebenden Fähigkeiten zur Durchflusszytometrie zu einer Abwärtsskalierung des Durchsatzes um mindestens 1-2 Größenordnungen im Vergleich zu dem der klassischen nicht-bildgebenden Durchflusszytometer geführt hat. Obwohl es eine komplexe morphologische Einzelzellanalyse anbieten könnte, die bei Standard-Durchflusszytometern 1 nicht möglich ist, fehlt der Imaging-Durchflusszytometrie im Allgemeinen ein ausreichender Durchsatz an idVermitteln zelluläre Heterogenität mit hohem statistischem Vertrauen. Dies ist notwendig für neue Entdeckungen in der Biologie und für ein Verständnis der Pathogenese von Krankheiten. Die zentrale technische Herausforderung liegt in der inhärenten Geschwindigkeitsbegrenzung, die durch die üblichen optischen Abbildungsstrategien auferlegt wird: Laserstrahlabtastung ( z. B. durch galvanometrische Spiegel) und / oder Bildsensoren ( z. B. ladungsgekoppelte Vorrichtung (CCD) und komplementäre Metall- Oxid-Halbleiter (CMOS)). Die Laserscangeschwindigkeit wird durch die mechanische Trägheit der Abtastspiegel intrinsisch eingeschränkt, während die Bildrate von CCD oder CMOS durch den grundsätzlichen Kompromiß zwischen Abbildungsgeschwindigkeit und Empfindlichkeit begrenzt wird ( dh die Erhöhung der Bildrate führt zu einer reduzierten Signaldetektionsempfindlichkeit , und umgekehrt).
Basierend auf einem all-optischen, ultraschnellen Bildkodierungsmechanismus wurde die optische Zeitstreck-Bildgebung als eine attraktive Plattform für den Hochdurchsatz-Durchflusszyklus gezeigtOmeter ohne Notwendigkeit der herkömmlichen Bildsensoren oder mechanischen Laserscans 2 , 3 . Ausführliche Beschreibungen des Arbeitsprinzips der Zeit-Streck-Bildgebung finden sich in den Referenzen 4 , 5 , 6 , 7 . Kurz gesagt besteht sie aus zwei austauschbaren Abbildungsschritten: (i) spektrale Kodierung (Wellenlängen-Raum-Abbildung), bei der die räumlichen Koordinaten der abgebildeten Probe auf unterschiedliche Wellenlängen über das Spektrum des lichtgepulsten Strahls 8 , 9 abgebildet werden, Und (ii) eine dispersive Fourier-Transformation (Wellenlängen-Zeit-Abbildung) 9 , bei der die Wellenlängenkomponenten einzelner Laserpulse über Gruppengeschwindigkeitsdispersion (GVD) in zeitliche (wellenlängengespannte) Wellenformen transformiert (gestreckt) werden ( Abbildung 1 ). Ein wichtigerMerkmal der Zeitstreck-Bildgebung ist die optische Verstärkung, die bei der Bekämpfung des Verlustes der Empfindlichkeit durch ultraschnelle Photodetektion und GVD-Verlust eine entscheidende Rolle spielt, wodurch das Bildsignal-Rausch-Verhältnis (SNR) verbessert wird, ohne dass es durch das Photodetektorrauschen 9 verunreinigt wird . Da jeder Laserpuls eine Zeilenabtastung der abgebildeten Probe kodiert, die orthogonal zum unidirektionalen Fluss der Zellen ist, wird eine effektive Zeilenabtastrate durch die Laserwiederholrate bestimmt, die typischerweise über 10 MHz hinausgeht. Diese ultraschnelle Operation ermöglicht eine unscharfe, einzellige Bildaufnahme bei einem Durchsatz von 10.000-100.000 Zellen / s ( dh 10-100 mal höher als herkömmliche Bildgebungsdurchflusszytometrie). Infolgedessen konnte die Zeitstreckungsdarstellung im Hochdurchsatz-, Einzelzell- und bildbasierten Screening einzigartige Anwendungen finden, insbesondere wenn es notwendig ist, unbekannte Heterogenität oder seltene / aberrante Zellen innerhalb einer beträchtlichen Population zu identifizieren (Tausende bis Millionen von Cel Ls), wie seltene Krebszellen-Screening 10 oder Mikro-Algen-Klassifizierung 11 .
Die Time-Stretch-Bildgebung beruht vorwiegend auf einer Hellfeld-Feldaufnahme (BF), aus der der Bildkontrast durch Lichtstreuung und Absorption aus den Zellen 2 , 3 , 9 , 10 , 11 erzeugt wird . Solche etikettfreien, einzelligen Bildgebungsfähigkeiten könnten die nachteiligen Effekte, die mit den fluoreszierenden Markierungen verbunden sind, wie z. B. Zytotoxizität und Photobleichung, umgehen und dennoch wertvolle Informationen für die Einzelzellanalyse basierend auf der zellulären und subzellulären Textur und Morphologie liefern. Diese etikettfreien Parameter erwiesen sich als wirksam für die Tiefenbildklassifizierung von Zellen, besonders wenn eine enorme Zellpopulation verfügbar ist 11 ,"Xref"> 12 Allerdings stellt die BF-Bildgebung in vielen Fällen keinen ausreichenden Kontrast dar, um die detaillierte Morphologie der etikettfreien transparenten Zellen zu zeigen. Für die Verbesserung des bildgebenden Kontrastes bei ultraschnellen Bildraten 13 , 14 , 15 wurden verschiedene etikettfreie, phasenkontrast- und zeitstreckenbildende Modalitäten entwickelt. Unter diesen Techniken wurde eine asymmetrische Erkennungszeit-Streck-Optikmikroskopie (ATOM) entwickelt, um den Phasendifferenz- (Differential-Interferenz-Kontrast- (DIC) -ähnlichen) Kontrast auf der Grundlage eines Konzepts ähnlich der Schlieren-Fotografie zu zeigen, Freie, kontrastreiche Bildgebung einzelner Zellen mit einer ultrahohen mikrofluidischen Geschwindigkeit (bis zu 10 m / s) 16 . Dieser Effekt kann leicht durch eine schräge Erfassung oder Beleuchtung durch teilweises Blockieren des bildkodierten Strahlengangs oder Kippen des Strahls vor der Photodetektion erzeugt werden. Ein weiterer Vorteil von ATOM ist seinUm gleichzeitig zwei Phasen-Gradienten-Kontraste entlang entgegengesetzter Orientierungen zu erwerben. Intensitäts-Subtraktion und Summierung von zwei entgegengesetzten Kontrastbildern ergeben den differenziellen Phasenkontrast bzw. den Absorptionskontrast aus dem gleichen Zeilen-Scan. Diese Arbeit stellt ein detailliertes Protokoll dar, das die Implementierung von ATOM beschreibt, einschließlich der Einrichtung des optischen Aufbaus, der Probenvorbereitung und der Datenerfassung und Visualisierung. Speziell zeigt diese Arbeit die ATOM-Operation mit der einzelligen Bildgebung von menschlichen Blutzellen, Krebszellen und Phytoplankton (Mikroalgen). Dies unterstreicht die Anwendbarkeit von ATOM auf die bildgebende Durchflusszytometrie nicht nur im biomedizinischen Bereich, sondern auch in der Meeres- und Biokraftstoffforschung 17 , 18 .
Es gibt mehrere technische Details, die während des ATOM-Systemaufbaus besondere Aufmerksamkeit erfordern. Zunächst ist zu beachten, dass asymmetrische / schräge spektral-kodierte Beleuchtungen im Absorptionskontrast Restphasen-Gradienten-Komponenten ( dh die Shadowing-Wirkung) einführen und die Verstärkung des Phasenkontrastes in ATOM beeinflussen können. Daher sollte dieser Effekt der Schrägbeleuchtung minimiert werden. Zweitens sollte betont werden, dass das Zeitmultiplex- oder Zeitverschachtelungssch…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Herrn P. Yeung für die Vorbereitung der MCF-7 für uns. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse des Forschungsstipendienrats der Sonderverwaltungsregion Hongkong, China (Projekt Nr. 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 und HKU 720112E), dem Programm für Innovation und Technologie (ITS / 090/14 ) Und dem Universitätsentwicklungsfonds der HKU.
Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X | Nikon | MRF07420 | Objective lens (Obj2) |
Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X | Olympus | RMS40X-PF | Objective lens (Obj1) |
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FC/APC Fiber Collimation Package | Thorlabs | F220APC-1064 | For outputing and collecting laser pulses |
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Infiniium High-Performance Oscilloscope | Agilent | DSOX91604A | To save the light-converted electrical signals |
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