Cytométrie de flux d'imagerie microfluidique par détection asymétrique Microscopie optique à temps-étirement (ATOM)

L'imagerie optique présente un outil puissant et un test basé sur des cellules pour visualiser (presque) de façon non invasive la répartition spatiale détaillée de plusieurs composants cellulaires / subcellulaires, dévoilant ainsi une multitude de signatures morphologiques, biophysiques et biomoléculaires des cellules. Cependant, cette capacité à extraire des informations à haute teneur provenant de cellules isolées a généralement été compromise lorsqu'une population de cellules énorme et hétérogène devait faire l'objet d'une enquête. Cela marque un compromis commun entre les tests basés sur des cellules entre le débit de mesure et le contenu. Un exemple notable est que l'ajout de capacité d'imagerie à la cytométrie de flux a entraîné une réduction du débit d'au moins 1 à 2 ordres de grandeur par rapport à celle des cytomètres classiques de flux de non-imagerie. Bien qu'il puisse offrir une analyse morphologique simple à une cellule qui n'est pas possible avec les cytomètres de flux standard ¹ , la cytométrie de flux d'imagerie n'a généralement pas de débit suffisant pour l'identificationD'enrichir l'hétérogénéité cellulaire avec une forte confiance statistique. Ceci est nécessaire pour de nouvelles découvertes en biologie et pour une compréhension de la pathogenèse des maladies. Le défi technique principal réside dans la limite de vitesse inhérente imposée par les stratégies d'image optique communes: la numérisation du faisceau laser ( par exemple, par des miroirs galvanométriques) et / ou des capteurs d'image ( par exemple, un dispositif à couplage de charge (CCD) Oxyde semi-conducteur (CMOS)). La vitesse de balayage laser est intrinsèquement limitée par l'inertie mécanique des miroirs de balayage, tandis que la cadence d'image de CCD ou de CMOS est limitée par le compromis fondamental entre la vitesse d'imagerie et la sensibilité ( c.-à-d. , et vice versa).

Basé sur un mécanisme de codage d'image tout-optique et ultra-rapide, l'imagerie optique à l'étirement du temps a été démontrée comme une plate-forme attrayante pour le cytrate de flux d'imagerie à haut débitOmeters, sans besoin des capteurs d'images classiques ou du balayage laser mécanique ^{2 , 3} . Des descriptions détaillées du principe de fonctionnement de l'imagerie étirable peuvent être trouvées dans les références ^{4 , 5 , 6 , 7} . En bref, il consiste en deux étapes de mappage interchangeables: (i) codage spectral (mappage de l'espace de longueur d'onde), dans lequel les coordonnées spatiales de l'échantillon imagé sont mappées à différentes longueurs d'onde sur le spectre du faisceau lumineux ^{8 , 9} , Et (ii) une transformation de Fourier dispersive (mappage de longueur d'onde) ⁹ , dans laquelle les composantes de longueur d'onde des impulsions laser individuelles sont transformées (étirées) par dispersion de vitesse de groupe (GVD) en formes d'ondes temporelles (longueur d'onde) ( Figure 1 ). Un importantLa fonctionnalité de l'imagerie étirable est l'amplification optique, qui joue un rôle essentiel dans la lutte contre la perte de sensibilité due à la photodétection ultra-rapide et à la perte de GVD, améliorant ainsi le rapport signal / bruit d'image (SNR) sans être contaminé par le bruit photodétecteur ⁹ . Étant donné que chaque impulsion laser code pour un balayage en ligne de l'échantillon imagé, qui est orthogonal au flux unidirectionnel des cellules, un taux de balayage de ligne efficace est déterminé par le taux de répétition laser, qui est généralement au-delà de 10 MHz. Cette opération ultra-rapide permet une capture d'image à une seule cellule sans flou, à un débit de 10 000 à 100 000 cellules / s ( c.-à-d. 10 à 100 fois plus élevé que la cytométrie de flux d'imagerie conventionnelle). En conséquence, l'imagerie temporelle pourrait trouver des applications uniques dans le dépistage à base d'images à une seule cellule à haut débit, surtout lorsqu'il est nécessaire d'identifier une hétérogénéité inconnue ou des cellules aberrantes / aberrantes dans une population importante (des milliers à des millions de Cel Ls), comme le dépistage de cellules cancéreuses rarement ¹⁰ ou la classification des microalgues ¹¹ .

L'imagerie étirable repose principalement sur la capture d'image de champ lumineux (BF), à partir de laquelle le contraste de l'image est généré par diffusion de lumière et absorption à partir des cellules ^{2 , 3 , 9 , 10 , 11} . De telles capacités d'imagerie à une seule cellule exemptes d'étiquettes pourraient contourner les effets néfastes associés aux étiquettes fluorescentes, telles que la cytotoxicité et la photoblanchiment, et fournissent pourtant des informations précieuses pour une analyse monocellulaire basée sur la texture et la morphologie cellulaire et sous-cellulaire. Ces paramètres exempts d'étiquettes se sont révélés efficaces pour la classification des images en profondeur, en particulier lorsqu'une population cellulaire énorme est disponible ^{11 ,}"Xref"> 12. Cependant, à plusieurs reprises, l'imagerie BF ne fournit pas un contraste suffisant pour révéler la morphologie détaillée des cellules transparentes exemptes d'étiquettes. Différentes modalités d'imagerie sans étiquetage, de contraste de phase et d'étirement du temps ont été développées pour améliorer le contraste de l'imagerie aux cadences d'images ultra-fines ^{13 , 14 , 15} . Parmi ces techniques, on a développé une microscopie optique (ATOM) à distance de détection asymétrique pour révéler le contraste de gradient de phase (différentiel-interférence-contraste-DIC) basé sur un concept similaire à la photographie de Schlieren, Imagerie libre et à contraste élevé de cellules individuelles à une vitesse microfluidique ultra-haute (jusqu'à 10 m / s) ¹⁶ . Cet effet peut être facilement généré par détection ou illumination oblique en bloquant partiellement le chemin du faisceau codé par image ou en inclinant le faisceau avant la photodétection. Un autre avantage d'ATOM est sonAfin d'acquérir simultanément deux contrastes de gradient de phase selon des orientations opposées. La soustraction d'intensité et la sommation de deux images de contraste opposé produisent respectivement le contraste de gradient de phase différentiel et le contraste d'absorption à partir du même balayage de ligne. Ce travail présente un protocole détaillé décrivant la mise en œuvre de l'ATOM, y compris la mise en place de la configuration optique, la préparation des échantillons et l'acquisition et la visualisation des données. Plus précisément, ce travail démontre l'opération ATOM avec l'imagerie monocellulaire des cellules sanguines humaines, des cellules cancéreuses et du phytoplancton (microalgues). Cela met en évidence l'applicabilité d'ATOM à la cytométrie de flux d'imagerie, non seulement dans l'arène biomédicale, mais aussi dans la recherche marine et biocarburants ^{17 , 18} .