Citometria del flusso microfluidico di imaging mediante rilevazione asimmetrica Microscopia ottica di stretching (ATOM)

L'imaging ottico presenta un potente strumento e un test basato su cellule (quasi) non invasivo visualizza la distribuzione spaziale dettagliata di molti componenti cellulari / subcellulari, scoprendo così una moltitudine di firme morfologiche, biofisiche e biomolecolari delle cellule. Tuttavia, questa capacità di estrarre informazioni di contenuto elevato da singole cellule è stata generalmente compromessa quando una popolazione enorme e eterogenea di cellule doveva essere studiata. Ciò segna un comune compromesso nei test basati su cellule tra il throughput di misura e il contenuto. Un esempio notevole è che l'aggiunta di capacità di imaging alla cytometria a flusso ha provocato un down-scaling del throughput di almeno 1-2 ordini di grandezza rispetto a quello dei citometri di flusso non-imaging classici. Sebbene possa offrire un'analisi complessa morfologica delle singole cellule che non è possibile con i citometri standard di flusso ¹ , la citometria a flusso di imaging generalmente manca di un throughput sufficiente a idImpongono l'eterogeneità cellulare con elevata fiducia statistica. Ciò è necessario per nuove scoperte in biologia e per acquisire una comprensione della patogenesi delle malattie. La principale sfida tecnica è rappresentata dal limite di velocità inerente imposto dalle comuni strategie di imaging ottico: scansione a raggi laser ( ad es., Con specchi galvanometrici) e / o sensori di immagine ( ad es., Dispositivo accoppiato a carica (CCD) Ossido semiconduttore (CMOS)). La velocità di scansione laser è intrinsecamente limitata dall'inerzia meccanica degli specchi di scansione, mentre la frequenza di fotogramma di CCD o CMOS è limitata dal compromesso fondamentale tra velocità di imaging e sensibilità ( vale a dire aumentando la frequenza del fotogramma porta a una sensibilità di rilevamento del segnale ridotta , e viceversa).

Basato su un meccanismo di codifica dell'immagine ultra-ottica e ultra-veloce, la visualizzazione ottica di time-stretch è stata dimostrata come una piattaforma attraente per il cyt di flusso di imaging ad alta velocitàSenza bisogno dei sensori di immagine convenzionali o scansione laser meccanica ^{2 , 3} . Le descrizioni dettagliate del principio di funzionamento dell'immagine a tratti di tempo si trovano nei riferimenti ^{4 , 5 , 6 , 7} . In breve, è costituito da due passi di mappatura intercambiabili: (i) codifica spettrale (mappatura spazio-lunghezza d'onda), in cui le coordinate spaziali del campione imaged vengono mappate a lunghezze d'onda diverse attraverso lo spettro della trave ^{8 , 9} , E (ii) una trasformazione di Fourier dispersiva (mappatura della lunghezza d'onda) ⁹ , in cui i componenti di lunghezza d'onda dei singoli impulsi laser vengono trasformati (allungati) tramite dispersione di velocità di gruppo (GVD) in forme d'onda temporali (a onda d'onda). Un importanteLa caratteristica della ripresa temporale è l'amplificazione ottica, che svolge un ruolo fondamentale nella lotta contro la perdita di sensibilità dovuta alla fotorivelazione ultra veloce e alla perdita di GVD, migliorando così il rapporto segnale / rumore (SNR) senza essere contaminati dal rumore del fotorivelatore ⁹ . Poiché ogni impulso laser codifica una linea di scansione del campione esaminato, ortogonale al flusso unidirezionale delle celle, una velocità di scansione efficace è determinata dalla velocità di ripetizione del laser, che è tipicamente oltre 10 MHz. Questa operazione ultra veloce consente di catturare immagini senza cifre a singola cella con un throughput di 10.000-100.000 celle / s ( vale a dire 10-100 volte superiori alla citometria di flusso di imaging convenzionale). Di conseguenza, l'imaging temporale potrebbe trovare applicazioni uniche in screening ad alta velocità, a singola cellula, in particolare quando vi sia la necessità di identificare eterogeneità sconosciuta o cellule rari / aberranti all'interno di una popolazione considerevole (da migliaia a milioni di persone). cel Ls), quali rari screening delle cellule tumorali ¹⁰ o la classificazione micro-alghe ¹¹ .

L'imaging a tratti di tempo si basa prevalentemente sulla cattura di immagini in campo luminoso (BF), da cui viene generato il contrasto dell'immagine mediante la dispersione della luce e l'assorbimento dalle cellule ^{2 , 3 , 9 , 10 , 11} . Tali funzionalità di imaging a singola cellula senza etichetta potrebbero escludere gli effetti nocivi associati alle etichette fluorescenti, come la citotossicità e la fotolibrazione, e tuttavia forniscono informazioni preziose per l'analisi delle singole cellule basate sulla texture e sulla morfologia cellulare e sub cellula. Questi parametri senza etichetta sono dimostrati efficaci per la classificazione profonda delle immagini delle cellule, soprattutto quando è disponibile un'enorme popolazione cellulare di ^{11 ,}"Xref"> 12. Tuttavia, in molte occasioni, l'imaging BF non riesce a fornire un sufficiente contrasto per rivelare la morfologia dettagliata delle celle trasparenti senza etichetta. Sono state sviluppate diverse modalità di imaging senza etichette, a contrasto di fase e di allungamento del tempo per migliorare il contrasto dell'immagine a velocità fotogrammi ultra veloci ^{13 , 14 e 15} . Tra queste tecniche, è stata sviluppata una microscopia ottica di rilevamento asimmetrico (ATOM) per rivelare il contrasto di fase (contrasto differenziale-interferenza-contrasto (DIC)) basato su un concetto simile alla fotografia Schlieren, Libera, ad alto contrasto di singole cellule ad una velocità microfluidica ultrasuoni (fino a 10 m / s) ¹⁶ . Questo effetto può essere facilmente generato mediante rilevamento o illuminazione obliqua bloccando parzialmente il percorso del fascio codificato in immagine o inclinando il fascio prima della fotodetazione. Un altro vantaggio di ATOM è il suo aPossibilità di acquisire simultaneamente due contrasti gradienti gradienti lungo orientamenti opposti. La sottrazione dell'intensità e la somma di due immagini a contrasto contrario rappresentano rispettivamente il contrasto gradiente differenziale di fase e il contrasto di assorbimento dalla stessa linea di scansione. Questo lavoro presenta un protocollo dettagliato che descrive l'implementazione di ATOM, tra cui la creazione dell'installazione ottica, la preparazione del campione e l'acquisizione e la visualizzazione di dati. In particolare, questo lavoro dimostra l'operazione di ATOM con l'imaging a cellule singole di cellule del sangue umano, cellule tumorali e fitoplancton (microalga). Ciò evidenzia l'applicabilità dell'ATOM alla citometria a flusso di imaging, non solo nell'arena biomedica, ma anche nella ricerca sul marino e sul biocarburante ^{17 , 18} .