Microfluidic Imaging Cytometría de flujo por Asimétrica de detección de tiempo de estiramiento Microscopía óptica (ATOM)

La imagen óptica presenta una poderosa herramienta y un ensayo basado en células para visualizar (casi) de forma no invasiva la distribución espacial detallada de muchos componentes celulares / subcelulares, descubriendo así una multitud de firmas morfológicas, biofísicas y biomoléculas de células. Sin embargo, esta capacidad para extraer información de alto contenido de células individuales ha sido generalmente comprometida cuando una enorme y heterogénea población de células tuvo que ser investigado. Esto marca una compensación común en los ensayos basados ​​en células entre el rendimiento de medición y el contenido. Un ejemplo notable es que la adición de capacidad de formación de imágenes a la citometría de flujo ha dado lugar a una disminución de la escala de rendimiento en al menos 1-2 órdenes de magnitud en comparación con la de la clásica no citometría de flujo de imágenes. A pesar de que podría ofrecer un análisis morfológico de células complejas que no es posible con citómetros de flujo estándar ¹ , la citometría de flujo de imagen generalmente carece de suficiente rendimiento para idEnriqueciendo la heterogeneidad celular con alta confianza estadística. Esto es necesario para los nuevos descubrimientos en biología y para obtener una comprensión de la patogénesis de las enfermedades. El desafío técnico clave radica en el límite de velocidad inherente impuesto por las estrategias de imagen óptica comunes: exploración por haz láser ( por ejemplo, por espejos galvanométricos) y / o sensores de imagen ( por ejemplo, dispositivo de acoplamiento de carga (CCD) Óxido semiconductor (CMOS)). La velocidad de escaneado láser está intrínsecamente limitada por la inercia mecánica de los espejos de exploración, mientras que la velocidad de fotogramas de CCD o CMOS está limitada por el equilibrio fundamental entre velocidad de imagen y sensibilidad ( es decir, , y viceversa).

Basado en un mecanismo de codificación de imágenes ultrarrápido y óptico, se ha demostrado que la imagen óptica de tiempo-estiramiento es una plataforma atractiva para el flujo de imágenes de alto rendimiento cytOmeters, sin necesidad de los sensores convencionales de imagen o escaneo láser mecánico ^{2 , 3} . En las referencias ^{4 , 5 , 6 , 7} se pueden encontrar descripciones detalladas del principio de funcionamiento de la proyección de imagen de tiempo-estiramiento. En resumen, consta de dos etapas de mapeo intercambiables: (i) codificación espectral (mapeado de espacio de longitud de onda), en el que las coordenadas espaciales de la muestra de imagen son mapeadas a diferentes longitudes de onda a través del espectro del haz de luz pulsada ⁸ , Y (ii) una transformación de Fourier dispersiva ⁹ , en la que las componentes de longitud de onda de los pulsos individuales de un láser son transformadas (estiradas) a través de la dispersión de velocidad de grupo (GVD) en formas de onda temporales (longitud de onda). Un importanteCaracterística de la formación de imágenes de tiempo-estiramiento es la amplificación óptica, que juega un papel crítico en la lucha contra la pérdida de sensibilidad debido a la fotodetección ultrarrápida y la pérdida de GVD, aumentando así la relación señal-ruido de imagen sin ser contaminado por el ruido fotodetector ⁹ . Puesto que cada pulso de láser codifica un barrido de línea de la muestra de imagen, que es ortogonal al flujo unidireccional de las células, se determina una velocidad de barrido de línea efectiva por la velocidad de repetición del láser, que está típicamente por encima de 10 MHz. Esta operación ultrarrápida permite una captura de imagen de una sola célula sin fluctuaciones a un rendimiento de 10.000 a 100.000 células / es ( es decir, 10-100 veces mayor que la citometría de flujo de imagen convencional). Como resultado, la proyección de imágenes de tiempo-estiramiento podría encontrar aplicaciones únicas en cribado basado en imágenes de una sola célula, especialmente cuando hay una necesidad de identificar heterogeneidad desconocida o células raras / aberrantes dentro de una población considerable (miles a millones de imágenes) Cel Ls), como el rastreo de células cancerosas raras ¹⁰ o la clasificación de microalgas [ ^11] .

La proyección de imagen de tiempo-estiramiento confía predominante en la captura de la imagen del campo brillante (BF), de la cual el contraste de la imagen se genera a través de la dispersión de la luz y de la absorción de las células ^{2 , 3 , 9 , 10 ,} Dichas capacidades de formación de imágenes de una sola célula libres de etiquetas podrían evitar los efectos perjudiciales asociados con las etiquetas fluorescentes, tales como la citotoxicidad y el fotoblanqueo, y proporcionar información valiosa para el análisis de una célula basada en la textura y morfología celular y subcelular. Estos parámetros libres de etiquetas se han demostrado eficaces para la clasificación profunda de las células, especialmente cuando existe una enorme población de células ^{11 ,}"Xref"> 12. Sin embargo, en muchas ocasiones, la formación de imágenes BF no proporciona un contraste suficiente para revelar la morfología detallada de las células transparentes sin etiqueta. Se han desarrollado diferentes modalidades de formación de imágenes de tiempo de estiramiento temporal sin contraste de etiquetas para mejorar el contraste de imagen a velocidades de fotogramas ultrarrápidos ^{13 , 14 , 15} . Entre estas técnicas, se desarrolló microscopía óptica de estiramiento-tiempo de detección asimétrica (ATOM) para revelar el contraste gradiente de fase (contraste diferencial de interferencia-contraste (DIC)) basado en un concepto similar a la fotografía de Schlieren, Libre de alto contraste de células individuales a una velocidad microfluídica ultra alta (hasta 10 m / s) ¹⁶ . Este efecto puede generarse fácilmente mediante detección o iluminación oblicua bloqueando parcialmente la trayectoria del haz codificado por imagen o inclinando el haz antes de la fotodetección. Otra ventaja de ATOM es suPara adquirir simultáneamente dos contrastes de gradiente de fase a lo largo de orientaciones opuestas. La substracción de intensidad y la suma de dos imágenes de contraste opuesto proporcionan el contraste diferencial de gradiente de fase y el contraste de absorción, respectivamente, de la misma exploración de línea. Este trabajo presenta un protocolo detallado que describe la implementación de ATOM, incluyendo el establecimiento de la configuración óptica, la preparación de la muestra, y la adquisición y visualización de datos. Específicamente, este trabajo demuestra la operación ATOM con imágenes de células únicas de células sanguíneas humanas, células cancerosas y fitoplancton (microalgas). Esto pone de manifiesto la aplicabilidad de ATOM a la citometría de flujo de imagen, no sólo en el ámbito biomédico, sino también en la investigación marina y de biocombustibles ^{17 , 18} .