Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.
The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the γ-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the γ-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.
Over the last years, temperature sensitivity has no longer been described as a somesthetic sense only, but also as a physiological function relevant for the olfactory system. In rodents, the main olfactory bulb receives input from the Grueneberg ganglion (GG), an organ in the nasal cavity, consisting of thermosensitive neurons. GG neurons respond to cool temperatures1 as well as to chemical stimuli, and their chemosensitivity is modulated by temperature fluctuations2. These observations suggest that the olfactory bulb may integrate chemical and temperature information collected at the nose. In order to explore this hypothesis, we present here a set of experiments enabling the detection of temperature responses in the olfactory bulb of non-transgenic animals, using the Xenopus laevis larva as a model. The organization of the olfactory system in these animals closely resembles that of mammals. The olfactory receptor neurons of premetamorphic X. laevis terminate in tufts, and make synaptic contacts with the dendrites of second-order neurons, the mitral cells. Pre- and postsynaptic fibers intermingle and form skein-like neuropil structures called glomeruli3. The abundant synapses of the glomerular layer represent the first processing center of olfactory information. Mitral cells further integrate the sensory input and convey it to higher olfactory areas.
We have developed a protocol combining electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) with calcium-sensitive and non-sensitive dyes followed by bolus loading of the postsynaptic network of glomeruli and mitral cells. The staining by electroporation of two spectrally distinct dyes loaded in the nasal cavities serves to single out the γ-glomerulus3 through its bilateral innervation by ORNs from both olfactory epithelia. Thus, the location of the γ-glomerulus is identified prior to further measurements. Subsequently, bolus loading4 with Fluo-8 acetoxymethyl (Fluo-8 AM) is carried out in a volume comprising the γ-glomerulus. Imaging calcium changes with fast confocal microscopy allows the visualization of temperature responses in the 3D neuropil surrounding the γ-glomerulus, a unique temperature-sensitive glomerulus in this system5. Mitral cells innervating this specific structure can also be identified by their Ca2+ signals responsive to induced temperature drops. Next, activity correlation imaging6 uses the specific Ca2+ traces of these cells to reveal the dendritic morphology of thermosensitive mitral cells. Alternating repeated applications of cold Ringer solution and chemical odorants in one measurement can be used to visualize the mitral cell networks for odor and temperature processing surrounding the γ-glomerulus and identify potential overlaps. To unambiguously assign the responses to either the chemical or the temperature stimulus, we constantly monitor temperature at the olfactory epithelium.
השיטות שהוצגו במסמך זה מכוונים עיבוד טמפרטורה הקלטה ב הנורה חוש הריח של Xenopus laevis ראשנים. כתמי הפרוטוקול הראשון ונוירונים מסדר שני ב נורה חוש הריח ומספקים הכנת מדגם שבו מערכת חוש הריח נשארת בעיקר ללא פגע. לפיכך, ההפעלה-glomerulus γ רגיש לטמפרטורה ניתן לנטר לעומת glomeruli שכנות הכימותרפיה הרגישה שלה. העצבוב הבילטרליים הייחודי של glomerulus זה דמיין ידי electroporation תא עם צבעים שונים גל. יתר על כן, טוען בולוס מאפשרת צביעת תאים צניפי פורש נפח גדול בתוך פקעת ההרחה. עיבוד רשת העצבי אותות מושרה הטמפרטורה מתגלים על ידי לקיחת מידות סידן עם יישומי גירוי חוזרים ונשנים ולאחר מכן לנתח את הנתונים עם הדמית מתאם פעילות.
פרוטוקול מבליט שני proce מכתים מתוחכם לדינים ונהלים הנוגעים לעניין, אשר שניהם דורשים מניפולציה ותרגול זהירים על מנת להשיג תוצאות מספקות לשחזור. במהלך electroporation כל פגיעה של חיות יש להימנע, במיוחד כאשר מיצוב אלקטרודות לתוך הנחיריים. באופן אופטימלי, ללא מגע עם אפיתל ההרחה אמור להתרחש. ראוי לציין, כי בעלי החיים עדיין חיים לאחר הליך electroporation וזמן ההתאוששות שלהם חייב להילקח בחשבון. אם המכתים נשאר חלש מדי אחרי סיבוב אחד של electroporation, אשר יכול לקרות בהתאם לסוגים של צבעים הרגילים, עוצמתו ניתן לשפר על ידי הגדלת ריכוז לצבוע בנחיריים. מאז מולקולות מצמידי dextran מועברות באמצעות מספר מנגנונים כולל הובלת אקסונלית איטית (במהירות של 1-2 מ"מ / יום 10) דיפוזיה פסיבית, אלטרנטיבה אחרת היא לחכות 48 שעות לאחר electroporation לפני הקרבת החיות. לחלופין, electroporation ניתן לחזור לאחר יום אחד של התאוששות.
jove_content "> טוען בולוס הוא שלב קריטי שכן כמות צבע הזנת התאים צניפי קשה לווסת תלויה בפרמטרים שונים כמו גודל קצה פיפטה ומיקום של היישום. ניטור ההליך תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal מוכיח להיות שימושי התאמה משך יישום צבע ובכך ליצור תוצאות מכתימות דומות ברחבי הכנות. יתר על כן, ראשני electroporated בעבר אמורים לשמש כדי לקבוע את המיקום הטוב ביותר עבור היישום לצבוע ידי זיהוי המיקום של הקבוצה הקטנה (המרכיב את-glomerulus γ). לכל היותר שלב קריטי במהלך מדידות הוא להימנע הוא השינוי לבן של המדגם. המעבר ניתן להימנע בקפידה על ידי מיצוב זרימת רינגר תחת מיקרוסקופ. כפי להגביל את הלבנה של השטח של עניין, זמן המדידה צריך להיות מופחת החיוני .בולוס מכתים טעינה עם צבעים רגישי סידן רק מספק מאודבניגוד מוגבל מאז תאים בריאים בעלי רמות סידן נמוכות בדרך כלל ובכך להראות קרינת בסיס חלשה. החלת הדמית פעילות מתאם עוקף מגבלה זו על ידי יצירת ניגוד על בסיס מבנים פעילות המדגישים עם אותות סידן דומים. שיטת ניתוח שלאחר רכישה זו מחשבת את גורם המתאם בין אות סידן של אזור נבחר של עניין (זכר הפניה) וכי של כל פיקסל בהיקף 3D. לכן, התוצאות המתקבלות תלוי מאוד על דפוס הפעילות נבחר עקבות התייחסות. אם ההתמקדות העיקרית היא לחזות דפוסי עצבוב תא צניפי, אות התייחסות נגזר הפעילות עצבית ספונטנית היא מועדפת, ובחירת תאי צניפי הפעיל ביותר תפיק את התוצאות הטובות ביותר. לחשיפת רשתות chemo- או תרמו-רגיש של תאי צניפי, עקבות התייחסות יחידות המכילות תגובות היסטידין או או רינגר קר צריכות להיות מסומנות. הבחירה של o glomerulus כולוr סומה תא צניפי כמו האזור של עניין לא תמיד לספק שמץ התייחסות ברורה, במיוחד אם המבנים להגיב לשני גירויים שונים שוכבים על גבי אחד את השני. במקרה כזה, הוא לעתים קרובות שימושי כדי לבחור שטח קטן יותר של glomerulus או גוף תא כמו אזור של עניין.
בעשורים האחרונים, electroporation תואר שיטה יעילה להכתים תאים בודדים או מרובים 11,12. הנה זה משמש תווית נוירונים קולטני ריח ספציפי. מולקולות מצומדות dextran לתת את היעילות הגבוהה ביותר, ועל צבעי רגיש שאינו סידן, בטווח של מבחר רחב ומכסה את הספקטרום המלא משמש בדרך כלל מיקרוסקופ פלואורסצנטי 13. עם זאת, צבעי רגיש סידן אשר electroporated בהצלחה לתוך הנוירונים קולטני ריח הם כרגע מוגבל dextran סידן-ירוק, סוגי הפולימרים Fluo-4 אם עדיין זמינים מסחרית. חוץ מזה, ההקלטות למקד בעיקר superficial שכבות על פני שטח הגחון של נורת חוש הריח בלבד, שכן את עומק החדירה של טכניקות מדידה מהירות מוגבל. שני פוטוני הדמיה יכולה בחלקו להתגבר על מגבלה זו, אך לעתים קרובות חסרת מהירות ומגבילה את כמות צבעי סידן רגיש לבחירה נוספת.
תארנו כאן פרוטוקול למדידת פעילות מושרה טמפרטורה הנורה חוש הריח. המוח neuropil נסרק ככרך תלת ממדים כדי להמחיש את רשתות הסלולר המורכבות המעורבים בעיבוד חוש הריח של טמפרטורה. מדידת פעילות מושרה טמפרטורה הנורה חוש הריח כבר מזמן דיווחה 5 ודורשת הליך אישית במיוחד משלב טכניקות שונות. הנכס העיקרי של הטכניקות שהוצגו לעיל היא כי מאות תאים הם צילמו בשלושה ממדים בתוך הכנה שבו רוב של מערכת חוש הריח נשאר שלם. יתרונות אלה לשים דרישות גבוהות על הטכניקות המכתימות כמו גם את המוח pפיצוי והדמיה. לדוגמא, electroporation התא וטעינת בולוס פגעו כמויות גדולות של תאי האפיתל ואת פקעת ההרחה, ובכך לאפשר ההדמיה של רשתות הסלולר שלמות. יתר על כן, את המסירה של אינדיקטורים כימיים באמצעות טעינת בולוס במקום fluorophores מקודד גנטית מאפשרת מדידות סט פוטנציאל גדול של מינים. חלופות אחרות כמו דגירת אמבטיה עם צבעי AM לעבוד בעיקר פרוסות הפוגעות פקעת ההרחה קשה, ומשאירות רק כמה מאה מיקרומטר של רקמות שלמות. לשם השוואה, הכנת ההר השלמה בשימוש בפרוטוקול שלנו מבטיחה למשל כי עצבוב הבילטרליים של-glomerulus γ נשאר שלם וללא הקלטות ובכך נלקחות במערכת עדיין פעילה. לבסוף, הדמיה עצמה נעשית על ידי מיקרוסקופ קו תאורה המאפשר רכישת כרכים 3D. מיקרוסקופיה קו תאורה היא אחת הטכניקות confocal מתן שיעורי הרכישה הגבוה ביותר האפשרי 6 </ Sup> אשר נחוצים כדי לכסות חלק גדול של נורת חוש הריח. איטי רכישת מערכות ניתן להשתמש אך יש חיסרון, כי את גודל נפח רשמה חייב להיות מופחת. בשנים האחרונות, שיטות אחרות לרכישת תמונה מהר פותחו ויכולות לשמש חלופות 14,15. אף על פי כן, קו-תאורת מיקרוסקופיה נשאר באחת מהשיטות הקלות ביותר כדי לקבל מהירות וגם ברזולוציה מתאימות. הנה כדלקמן קצת מידע כקווים מנחים לבחירת setups הדמיה המתאימה. מאז הדמית סידן נעשית בתוך מן הכנות מוח עבות, ההתקנה צריכה לספק confocality גוון המטרות צריכות מפתח נומרי של 1.0 ומעלה. עבור נקודת התייחסות, ההקלטות שצולמו במיקרוסקופ תאורת הקו מתאימות תמונות שצולמו באמצעות מיקרוסקופ סריקת ליזר רגיל עם גודל חריר של 0.5-1 יחידות אווריריות. מהירויות רכישה מהירות רצויות. נפח עם עובי של 20 מיקרומטר מכוסה לפחות 5 ליטראיירס, שדה לרוחב המבט של 100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר גודל פיקסל של 0.5 מיקרומטר או קטן יש לסרוק במהירות מינימלית של 1 הרץ לכל מחסנית. צמצום confocality יכול להגדיל את כמות הפוטונים נספר ובכך מאפשר לרכישות מהר במידת הצורך, אבל יש את החיסרון של הקלטה יותר out-of-פוקוס אור. עם זאת, מאז גישה כזו מגדילה את עובי הפרוסות האופטיות, זה באמת יכול להקל על האיתור של דנדריטים באמצעות z-מישורים שונים לאחר היישום של ACI 6.
את הכלים הדרושים כדי ללמוד עיבוד הטמפרטורה בהרחבה ברשתות פקעת ההרחה מוצגים במסמך זה. פעילות טמפרטורה הנגרמת נרשם נוירונים מסדר ראשון ושני באמצעות צבעים סידן רגיש אותות הן נכנסים ויוצאים מן-glomerulus γ. יתר על כן, את המידה שבה תאים צניפי הפרט לעבד הן מידע כימי וטמפרטורה ניתן להעריך. מאז לאה כןves נורה חוש הריח שלם, את התפקיד של העצבוב הבילטרלי עיבוד חוש הריח יכול להיחקר נוסף. ההליך הוא גם שימושי עבור חושף האם וכיצד תרמו ו chemoinformation מקודד חופפים 5 רשתות חוש הריח. לבסוף, טכניקות הנ"ל אינן מוגבלות בחקר תגובות הטמפרטורה הנורה חוש הריח אבל יכולות להיות מיושמות על הערכה כוללנית יותר של מערכת חוש הריח, ובעיקר רשתות עיבוד הסלולר גדולים בשלושה כרכים ממדיים. טעינת בולוס והדמיה מתאם הפעילות הם כלים רבי עוצמה כדי לצפות ולהשוות את הפעילות של עשרות נוירונים, מה שהופך אותם החלים על רשתות מוח שונים 16.
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by the DFG Excellence Cluster 171, the Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, the Bernstein Center for Computational Neuroscience and the ENC-Network, an Erasmus Mundus Joint Doctoral Program. The authors thank Stephan Junek, Mihai Alevra and Guobin Bao for providing MATLAB codes and custom-written programs for image evaluation and data analysis.
Reagents | |||
Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
Funnel applicator | (Custom-made) | ||
Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
Objective W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
Objective W Plan-Apochromat 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |