Aufzeichnung von Temperatur-induzierte neuronale Aktivität durch Calcium Überwachen von Änderungen in der Riechkolben von<em> Xenopus laevis</em

Alle Versuche mit Xenopus laevis Kaulquappen wurden nach den Richtlinien der Universität Göttingen Ausschuss für Ethik in der Tierversuche genehmigt durchgeführt. 1. Die Elektroporation Wählen Sie Tiere der Stufen 49-54 nach Nieuwkoop und Faber 7. Stellen Sie sicher, dass das Aufzeichnungs Aufbau eines Stereomikroskopes mit einem großen Arbeitsabstand und eine Elektroporationsvorrichtung besteht, die Spannungsimpulse von 20 V für 20 msec bei einer Frequenz von mindestens 2 Hz anwenden können. Übernehmen Sie die Spannungsimpulse über zwei Platinelektroden mit einem groben Durchmesser von 200 & mgr; m, so dass sie ohne Schaden zu verursachen in die Kaulquappen "Nasenlöcher eingeführt werden kann. Bereiten Kristalle eines Dextran konjugierten Farbstoff (beispielsweise Calcium Green 10 kDa Dextran oder Alexa Fluor 647 10 kDa Dextran) , indem die typischerweise gelieferte Menge von 5 mg in 100 ul destilliertem Wasser gelöst und lassen kleine Tröpfchen von2 ul trocken auf einem Blatt Parafilm. Anmerkung: Die Kristalle in weniger als einem Tag trocken und kann danach bei -18 ° C im Gefrierschrank für eine Dauer von mehr als einem Jahr gelagert werden. Anesthetize die Tiere, indem sie in Leitungswasser, das 3% Tricaine Methansulfonat für 1-2 min platzieren, bis er die chirurgische Anästhesie Zustand gekennzeichnet erreicht durch eine verminderte Herzfrequenz, Verlust aller Bewegungen und fehlende Antworten auf mechanische Reize. Tauchen Sie den narkotisierten Tier für 10 Sekunden in reinem Leitungswasser. Legen Sie das Tier auf einem Gelkissen und fixieren Sie sie mit Nadeln herum platzieren, ohne sie zu beschädigen. Hinweis: Nehmen Sie das Tier nicht beheben, indem Nadeln durch seine Haut Stossen. Trocknen Sie den Bereich vorsichtig die Nase mit einem Gewebe umgeben. Legen Sie das Tier unter dem Stereomikroskop und konzentrieren sich auf die Nase. Verwenden einer Pinzette, einen Farbstoff Kristall von Größe zu wählen, die Nasenloch Loch passend, legen Sie es in eine der Nasenhöhlen und warten, bis es vollständig auflöst, which dauert weniger als 1 min. Wenn die Kristalle kleiner sind, fügen Sie 2 oder 3 in jeden Hohlraum, bis sie eine nicht-durchlässiger, hochkonzentrierte Lösung herzustellen. Platzieren Sie die Kathode auf der Haut der Kaulquappe und der Anode in eine der Nüstern. Hinweis: Diese besondere Einstellung zu den in Schritt 1.3 genannten Farbstoffe gilt. Für Farbstoffe mit einer anderen Polarität, die Färbeergebnisse kann durch Anordnen der Kathode in die Nasenlöcher verbessert werden. Wenn Sie sich unsicher über die Polarität des Farbstoffs können beide Elektroden gleichzeitig in der Nase (eine pro Nasenloch) angeordnet werden, und die Polarität zwischen den einzelnen Spannungsimpulse abwechselten. Bewerben sechs Impulse von 20 V und 20 ms mit etwa 0,5 Sekunden von Stimulus-Intervall. Hinweis: Kleine Blasen um die Elektrode in das Nasenloch bei der Elektroporation vorgesehen, dass die Elektroden in Kontakt mit der Haut und der Lösung in das Nasenloch erscheinen soll. Wenn keine Blasen sichtbar überprüfen Sie die Anschlusskabel sind und stellen Sie sicher, dass die Elektroporation device liefert die gewünschte Spannungsimpuls. Wiederholen Sie den Vorgang (1,9-1,11) für das zweite Nasenloch. Übertragen Sie die elektroporierten Kaulquappe in ein Becherglas mit Leitungswasser bei Raumtemperatur gefüllt. Warten Sie 5 bis 10 Minuten, bis das Tier das Bewusstsein wiedererlangt und wieder seine Schwimmen. Ziehen Sie es und lassen Sie es für mindestens 1 Tag erholen, während der der Farbstoff entlang der Riechnerv zu den Riechkolben transportiert wird. Verwenden Sie die elektroporierten Tiere innerhalb von 1-7 Tagen nach der Elektroporation für die beste Bildergebnisse. Geben Sie mindestens 24 Stunden Zeit für Farbstofftransport und Erholung vor Bildgebung. 2. Ganze Berge Vorbereitung Anästhesieren das Tier in Leitungswasser, enthaltend 3% Tricaine Methansulfonat, bis alle Bewegungen aufgehört haben, und es reagiert nicht mehr auf mechanische Stimulationen. Übertragen Sie die Kaulquappe zu einem Gel-Kissen unter einem Stereomikroskop und fixieren Sie es fest, indem Sie auf jeder Seite der fo Nadeln durch die Haut Stossenrebrain. Opfere die Kaulquappe durch sein Rückenmark Trennen. Verwenden Sie ein Skalpell einen Block von Gewebe beide Nasenhöhlen enthält , zu sezieren aus, die Geruchsnerven und Riechkolben (Abbildung 1A). Machen Sie den ersten Einschnitt nahe an linken Nasenflügel, ohne es zu berühren-und die Klinge nach vorne Schneiden neben dem linken Nervus olfactorius und Birne bis zum telencephalic-diencephalic Grenze bewegen. Do ebenfalls auf der rechten Seite. Isolieren Sie die Vorbereitung von dem Rest des Nervensystems durch einen endgültigen Schnitt hinter dem Telenzephalon machen. Entsorgen Sie den Körper des Kaulquappe und vorsichtig den Gewebeblock drehen den Kopf, so dass die Bauchseite des Gehirns Vorbereitung nach oben zeigt. Pin der Gewebeblock wieder durch Einsetzen zwei Nadeln zwischen den Geruchsnerven. Einen Tropfen Frog Ringer – Lösung (98 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 5 mM Glucose, 5 mM Na-Pyruvat, 10 mM HEPES, eingestellt auf pH 7,8, osmolarität von 230 mosmol / L) auf das Gewebe. Entfernen Sie die Meningen Abdeckung der Axon Sortierzone und die Riechkolben, indem sie drei Schnitte mit einer feinen Schere. Ausgehend von der hinteren Kante des Gewebeblocks, schneiden caudorostrally eng entlang des linken Bulbus olfactorius, bis der Eintrittspunkt der Geruchsnerven in den Lampen (das Axon Sortierzone). Wiederholen Sie Schritt 2.8 für die rechte Hemisphäre. Heben Sie die Meningen mit einer Pinzette und den dritten Schnitt zu machen, die senkrecht zu den vorherigen an der Axon Sortierzone. Hinweis: Die Bauchseite des Bulbus olfactorius für die Bildgebung und Bolus-Laden jetzt zugänglich ist. Um die Bildqualität im Durchlichtbild, wiederholen Sie den Vorgang für die dorsale Seite zu verbessern. Diese zusätzlichen Schritte können die Navigation der Mikropipette zur Bolus-Laden zu erleichtern, sind aber nicht unbedingt erforderlich. Übertragen Sie die Probe auf eine Aufnahmekammer mit Frosch Ringer für die Weiterverarbeitung und Bild gefüllt. Machture, dass die Bauchseite mit einem Netz aus Nylonfasern nach oben und zur Sicherung der Probe wird mit Blick auf überspannt einen kleinen Platin-Rahmen. Für eine einfachere Anwendung von Stimuli stellen die Nasenhöhlen auf einer der Nylonfasern. 3. Bolus Loading Auflösen 50 ug des Calcium AM – Farbstoff (zB Fluo-08.00 Uhr) in 20 & mgr; l Dimethylsulfoxid (DMSO) , die 20% Pluronic F-127 (w / v) , um eine Stammlösung von AM Farbstoffes herzustellen. Frieren Sie die Stammlösungen in kleinen Portionen von 1-2 & mgr; l Volumen. Die Stammlösung ist stabil für mindestens ein halbes Jahr, aber Gefrier-Auftau-Zyklen vermeiden. Verwenden Sie einen Mikropipette Abzieher und ziehen Pipetten mit einem Widerstand von 5-8 MOhm und einem Spitzendurchmesser von 1-2 um. Man löst die vorbereitete Vorratslösung des Farbstoffes in Frog Ringerlösung in einer Konzentration von 250-500 & mgr; M. In MK571 zu einer Konzentration von 500 erreichen uM multidrug resistance Transporter zu blockieren. Füllen Sie die Mikropipette mit 10 ul der Lösung, die eine längliche Pipettenspitze und entfernen Sie alle Luftblasen durch den Mikro schnippen. Montieren Sie die Mikropipette in der Pipettenhalter und stellen Sie sicher, dass der Druck angewendet werden kann entweder manuell mit einer Spritze oder einem pneumatischen Arzneimittelausstoßvorrichtung und überwachen den ausgeübten Druck mit einem Messgerät. Wenn möglich, verwenden Sie ein Mikroskopaufbau mit der Fähigkeit, die injizierte Farbstoff zu erregen, so dass der Abfluss aus der Mikropipettenspitze sichtbar gemacht werden kann und angepasst. Idealerweise mit einem konfokalen Imaging-Setup verwenden. Verwenden ein aufrechtes Mikroskop mit einem Immersionsobjektiv, so dass das Gewebe mit der Mikropipette erreicht werden kann. Legen Sie die ganze Berg Vorbereitung unter dem Mikroskop, folgen Sie den Riechnerv, bis die Glühbirne und konzentrieren sich auf den Bereich von Interesse im Riechkolben. Perfuse frische Ringer-Lösung durch die Aufnahmekammer, um die Lebensfähigkeit der Zubereitung zu erhöhen und den Farbstoff undichten auswaschenvon der Mikropipettenspitze. Senken Sie die Pipette auf die Oberfläche des Riechkolbens, mit der Spitze nach in die rostrale Richtung der Zubereitung. Eine kleine und konstante positive Druck (~ 25 hPa) auf die Mikropipette Verstopfen der Pipette zu verhindern, und sanft in das Gewebe einzuführen. Sobald die Pipette die äußeren Gewebeschichten durchbrochen hat, verschieben Sie es in einer rostro-dorsale Richtung in die Mitral-Zellschicht. (Beachten Sie, dass eine Gegenfärbung der olfaktorischen Rezeptorneuronen durch Elektroporation hilfreich ist die Mikro Position einzustellen.) Idealerweise legen Sie die Pipettenspitze in einem Abstand von 50 bis 100 & mgr; m von der gewünschten Aufnahmeort. Für den temperaturempfindlichen γ-Glomerulus Anfärben, Ziel eine Fläche etwa 50 um rostral von der Position des präsynaptischen Neuropil des γ-Glomerulus. Tragen Sie einen positiven Druck im Bereich von 100 bis 200 hPa. Einstellen der Druckfestigkeit in Abhängigkeit von der Größe derdie Mikropipettenspitze. Bestätigen Sie den Abfluss aus der Pipette durch für leichte Gewebe Bewegungen sichtbar unter Brightlight Beleuchtung zu beobachten, wenn der Druck zum ersten Mal angewendet wird. Halten Sie einen konstanten Druck für etwa 10 Minuten, während die Mikropipette im Gewebe bleibt. Wenn möglich, überprüfen Sie die Neuropil in der Zwischenzeit für die Zellbelastung unter Fluoreszenzbeleuchtung als erfolgreiche Laden in sichtbare Zelle somata Färbung führen wird mit Intensität im Laufe der Zeit zu erhöhen. Hinweis: Oft ist der Grund für erfolglose Belastung ist aufgrund von Gewebe Pipette Verstopfung der Spitze oder aggregierte Farbstoff Cluster eingeben. Es ist manchmal möglich, die Pipette zu retten, indem Sie vorsichtig seine Spitze gegen die untere Oberfläche des Aufzeichnungskammer zu brechen. Allerdings sollte die Pipettenspitze nicht wenige Mikrometer nicht überschreiten. Compensate größere Öffnungen für Pipetten mit niedrigerem Druck während Bolus Laden Anwendung. Nach den 10 Minuten der Belastung und reduzieren den ausgeübten Druck auf Null gesetzt und die Färbung überprüfen. Hinweis: Die Größe des verschmutzten Bereich variiert beträchtlich und hängt von mehreren Parametern, wie Menge des injizierten Farbstoff und Lage der Ausstoßstelle. Eine gute Färbung erstreckt sich über eine Fläche von etwa 100 & mgr; m × 100 & mgr; m. Wenn die verschmutzten Bereich zu klein ist oder nicht den gewünschten Aufnahmeort abdecken, wiederholen Sie die Schritte 3,10-3,13. Verwenden Sie die gleiche Mikropipette für die nächste Injektion, wenn sie noch nicht verstopft ist. Warten Sie mindestens 30 Minuten nach der letzten Injektion, bevor Sie irgendwelche Experimente beginnen Farbstoffaufnahme und Deesterifizierung zu ermöglichen. Weiter die Aufnahmekammer mit frischen Ringer-Lösung jederzeit zu perfuse. 4. Messeinstellungen Stellen Sie sicher, dass die Messanordnung mit ausreichender Geschwindigkeit eines konfokalen Mikroskops besteht dreidimensionale Volumen aufzunehmen. Wählen Sie eine Erfassungsrate von mindestens 1 Hz pro Stapel. Hinweis: Geeignete Konfigurationen umfassen zum Beispiel Line-Beleuchtung Mikroskope Abtasten der Probe zeilenweise anstelle von Punkt punkt. Eine einfache Realisierung eines solchen Einrichtung wurde zuvor 6 beschrieben. Andere Optionen sind Spinning Disk-Mikroskope. Wenn keine solche Einrichtung vorhanden ist, ist es immer noch möglich, kleinere Bereiche mit einer normalen Punkt-Scan-Einrichtung zu messen. Stellen Sie die Messparameter so, dass ein Volumen groß genug, um die Größe eines Glomerulus zu passen abgedeckt werden kann. Anmerkung: Die typische Dicke eines Aufzeichnungsvolumen im Bereich von 20 & mgr; m ist, die durch mindestens 5 Schichten überzogen werden soll. Überprüfen Sie alle präsynaptischen Messungen zum Bleichen. Stellen Sie die Laserleistung, bis die mittlere Fluoreszenzintensität der aufgezeichneten Bilder nicht über den Zeitverlauf der Aufnahme fällt. Begrenzen Sie die Messzeit und Bereich für Aufnahmen auf der postsynaptischen Seite Bleichen so weit wie möglich zu vermeiden, obwohl für Messungen von mehr als 20 bis 30 sec Bleichen wahrscheinlich auftritt. 5. Geruch Anwendung und Temperaturexperimente Gießen 25ml frischem Ringer-Lösung in einem 50 ml-Röhrchen (vorher bei 4 ° C gelagert). Das Röhrchen wird in einem Eiskübel. Überwachen die Temperatur des abgekühlten Ringer durch die saubere Sonde eines Thermometers in das Rohr eingeführt wird. Warten Sie, bis die Temperatur unter 1 ° C fällt vor dem Start des Experiments. Vorbereitung 50 ml L-Histidin, gelöst in Ringer-Lösung bei einer Konzentration von 10 uM. Verwenden Sie einen Trichter Applikator 8 oder ähnliche Anwendungssysteme ermöglicht Stimulus Lieferung gleichzeitig an die Perfusion Ringer , so dass der Wasserstrom in der Kammer während der Freigabe der Stimulus – Lösung konstant und ununterbrochen bleibt. Positionieren des Trichters in der Weise, dass die distale Austritts weniger als 1 mm entfernt von dem olfaktorischen Epithel. Legen Sie eine NiCr-Ni-Temperatursensor in ein digitales Thermometer nahe dem Epithel und dem Auslass des Trichters Applikators verbunden. Draht, der die Thermometer Ausgabe-Port an einen Computer zu erfassen und visuell disspielen Spannungsänderungen reflektieren kleine Temperaturschwankungen. Vor dem Versuch, schließen Sie einen anderen Thermosensor zu einem Standard-Thermometer, um die Spannungs-Temperatur-Skalierungsfaktor zu etablieren. Umfrage der Badtemperatur im Aufnahmeraum und sicherzustellen, dass es nicht 22 ° C nicht übersteigt. Starten Sie die Bildaufnahme und gelten sequentiell 200-400 ul kalter Ringer, L-Histidin und Raumtemperatur-Ringer (20-22 ° C) über eine elektronische Pipette mit einem Interstimulus Intervall von 20-30 sec. Für eine bessere Steuerung der Reizapplikation, lassen Sie die Anregung mit einem Triggersignal von dem gewählten Bildgebungsaufbau zum Pipetten wenn möglich gesendet. Wiederholen Sie die Anwendung Protokoll für reproduzierbare Ergebnisse. Nehmen Sie Sätze von mehr Aufnahmen mit mehreren Runden der Stimulation, da sie für die Post-Bildanalyse mit Aktivität Korrelation Bildgebung vorzuziehen sind. Hinweis: Ein Kompromiss zwischen der Aufzeichnungszeit und der Scheibe Lebensfähigkeit hatgefunden werden. Messungen von ca. 2 min Abdeckung 6 Stimulusanwendungen ausreichende Aktivität für eine gute Rekonstruktion des Netzes. 6. Bildverarbeitung Activity Correlation Imaging (ACI) Bildverarbeitung der Präsynaptische Recordings In Aufnahmen mit Stimulation durch Kalt Ringer – Lösung und Histidin, zeichnen die temperaturempfindliche γ-Neuropil von der benachbarten Histidin empfindlichen Glomerulus durch ihre unterschiedliche Reaktionsprofile (siehe Kludt et al. 5). Erstellen eines maximalen Intensitätsprojektion in der axialen Richtung von Aufnahmen des Gehirns Zubereitung in denen ORNs mit zwei verschiedenen Farbstoffen elektroporiert wurden, um die bilaterale Innervation des γ-Glomerulus zu visualisieren. Bildverarbeitung der postsynaptischen Recordings Mit Activity Correlation Imaging (ACI) Wählen Aufnahmen mit ausreichender Zeitpunkten (mehr als 100 Frames) und eine anständige Menge an Aktivität (mindestens zwei Veranstaltungen). Hinweis: Die Aktivität kann entweder spontan sein, die Prozesse der einzelnen Mitralzellen zu offenbaren oder induziert durch mehrere Anwendungen von Stimuli während der gleichen Aufnahme der zellulären Netzwerke durch die olfaktorischen Stimuli aktiviert zu offenbaren. Wählen Sie Aufnahmen, wo die gemessenen Strukturen bewegen nicht mehr als 2-3 Pixel über den Zeitverlauf der Aufnahme. Hinweis: Aufnahmen mit zu viel Bewegung kann in Kludt et al durch Anlegen einer Verschiebung Korrekturverfahren gerettet werden 5. Überprüfen Sie, ob die Aufnahmen von Bleich leiden. Wenn die durchschnittliche Intensität des gesamten Bildes fällt über den Zeitverlauf des Aufzeichnungs, Bleich Korrektur erforderlich ist, überspringen sonst die nächsten beiden Schritte. Berechnen der linearen Trend für die Zeitspur jedes Pixels durch eine lineare Regression durchführt. das Ergebnis von jedem Pixel zu subtrahieren einzeln die lineare componen zu beseitigent der Bleich. Hinweis: Als Alternative Legendre Fitting kann verwendet werden , wie beschrieben von Bao und Schild 9. Laden Sie die ready-to-use MATLAB – Skript zusammen mit einer Schritt- für -Schritt – Anleitung für die Aktivität Korrelation Bildgebung (ACI) , wie von Junek et al. 6 Hinweis: Folgen Sie den beschriebenen Schritten in Junek et al 6 als eine Alternative zur Verwendung der bereitgestellten MATLAB – Skript.. Bewegen Sie das 'aci.m' Dateien 'matVis.m' und 'aci_roiSelector.m' aus dem heruntergeladenen Behälter in den MATLAB-Pfad des Systems zur Datenauswertung verwendet. Laden die Rohdaten in Schritt erworben 5,8 als Variable MATLAB Benutzerarbeitsbereich organisiert als [x, y, z, t] -Matrix mit x und y mit Bezug auf die seitlichen Abmessungen, z, der axialen Richtung und t, der Zeitverlauf . Rufen Sie "aci 'aus der MATLAB-Kommandozeile. In der Benutzeroberfläche (UI)die angezeigt wird, wählen Sie "Daten vorbereiten", dann wählen Sie die Variable, die Daten und ein Verzeichnis enthalten, in denen die Ergebnisse gespeichert werden. Hinweis: Für eine vollständige Beschreibung der Benutzeroberfläche das Handbuch finden Sie in der aci Skript begleitet. Blättern Sie durch die gemessenen z-Schichten, die durch den entsprechenden Schieberegler in der Benutzeroberfläche bewegen sich einen Überblick über die Varianz der Karte angezeigt zu bekommen. Geben Sie die Größe der Region of Interest (ROI) in der Benutzeroberfläche. Für eine mitrale Zellsoma der ROI passen ungefähr 10 & mgr; m in der lateralen und 5 um in der axialen Richtung zu erstrecken. Für eine Glomeruli, die etwas höhere Werte von 20 & mgr; m seitlich und 10 & mgr; m in axialer Richtung geeignet sind. Hinweis: Der ROI Größe als eine Anzahl von Pixeln eingegeben werden, die auf der Pixelskalierung für die Aufzeichnung gewählt wird, hängt. Wählen Sie einen ROI der γ-Glomeruli und zusätzliche Bereiche für jeden sichtbar soma der umliegenden Mitralzellen enthält, indem Sie mit der mittleren Maustaste auf die cente klickenr der Zelle / Glomerulus. Schließen Sie die Haupt-UI, die die Berechnung der Korrelation löst Karten für alle Referenzspuren. Das Ergebnis wird automatisch gespeichert und angezeigt.