Opname-temperatuur-geïnduceerde neuronale activiteit door middel van monitoring Calcium Veranderingen in de Olfactorische Bulb van<em> Xenopus laevis</em

Alle experimenten met Xenopus laevis kikkervisjes werden uitgevoerd volgens de door de Universiteit van Göttingen Comité van de ethiek in de Animal Experimentation goedgekeurde richtlijnen. 1. Elektroporatie Kies dieren fasen 49-54 volgens Nieuwkoop en Faber 7. Zorg ervoor dat de opname opstelling bestaat uit een stereomicroscoop met een grote werkafstand en een elektroporatie-inrichting die spanningspulsen kunnen toepassen van 20 V gedurende 20 msec bij een frequentie van ten minste 2 Hz. Breng de spanningspulsen via twee platina-elektroden met een ruw diameter van 200 urn zodat daarmee de neusgaten kikkervisjes "kan worden ingebracht zonder schade. Bereid kristallen van dextran geconjugeerd kleurstof (bijvoorbeeld Calcium Green 10 kDa Dextran of Alexa Fluor 647 10 kDa dextran) door het oplossen van de typisch geleverde hoeveelheid van 5 mg in 100 pl gedestilleerd water en laten kleine druppeltjes2 pl droog op een vel Parafilm. Opmerking: De kristallen droog in minder dan een dag en kan daarna worden opgeslagen bij -18 ° C in de vriezer gedurende meer dan een jaar. Verdoven dieren door ze in leidingwater met 3% tricaïne methaansulfonaat 1-2 min totdat de chirurgische verdoving die wordt gekenmerkt door bereikt vertraagde hartslag, verlies van alle bewegingen en gebrek aan respons op mechanische stimuli. Dompel de verdoofde dier voor 10 sec in zuiver water uit de kraan. Leg het dier op een gel kussen en zet het vast door het plaatsen van naalden omheen zonder nadelige gevolgen voor het. Let op: Laat het dier niet op te lossen door porren naalden door zijn huid. Voorzichtig droog het gebied rond de neus met een tissue. Plaats het dier onder de stereomicroscoop en focus op de neusgaten. Gebruik een tang om een ​​kleurstof kristal van grootte overeenkomen met het neusgat gat halen, plaats deze in een van de neusholten en wacht tot het volledig oplost, which duurt minder dan 1 minuut. Als de kristallen kleiner, voeg 2 of 3 in elke holte, totdat een ondoorzichtige hoog geconcentreerde oplossing te produceren. Plaats de kathode op de huid van het kikkervisje en de anode in een van de neusgaten. Let op: Deze bijzondere instelling geldt voor de hierboven in stap 1.3 kleurstoffen. Voor kleurstoffen met een andere polariteit, kan de kleuringen worden verbeterd door het plaatsen van de kathode in de neusgaten. Als twijfelt over de polariteit van de kleurstof, beide elektroden kan worden gelijktijdig in de neusgaten (één per neusgat) geplaatst, en de polariteit afwisselend één spanningspulsen. Solliciteer zes pulsen van 20 V en 20 msec met ongeveer 0,5 sec van de stimulus interval. Opmerking: Kleine belletjes moet tijdens de elektroporatie voorwaarde dat de elektroden in contact met de huid en de oplossing in het neusgat rond de elektrode in het neusgat weergegeven. Als er geen luchtbellen zichtbaar zijn controleer de verbindingskabels en zorg ervoor dat de electroporating Device levert de gewenste spanningspuls. Herhaal de procedure (1,9-1,11) voor de tweede neusgat. Breng de geëlektroporeerd kikkervisje in een beker gevuld met kraanwater bij kamertemperatuur. Wacht 5 tot 10 minuten totdat het dier terug bij bewustzijn komt en hervat haar zwemmen. Voeden en laten herstellen gedurende ten minste 1 dag waarin de kleurstof wordt getransporteerd langs de reukzenuw naar de olfactorische knobbel. Gebruik de geëlektroporeerde dieren binnen 1-7 dagen na de elektroporatie voor de beste beeldvormende resultaten. Geef ten minste 24 uur tijd voor kleurstof transport en herstel voor de beeldvorming. 2. Hele Mount Voorbereiding Verdoven van het dier in leidingwater met 3% tricaïne methaansulfonaat totdat alle bewegingen zijn gestopt en niet meer reageert op mechanische prikkels. Breng het kikkervisje een gelkussen onder een stereomicroscoop en stevig vast door poking naalden door de huid aan weerskanten van de forebrain. Offer het kikkervisje door het doorsnijden van haar ruggenmerg. Gebruik een scalpel te ontleden uit een blok van weefsel die zowel neusholten, de olfactorische zenuwen en olfactorische bollen (figuur 1A). Maak de eerste incisie in de buurt van linker neusgat, zonder het aan te raken-en bewegen het mes naar voren snijden langs de linker reukzenuw en gloeilamp tot de telencephalic-diencephalic grens. Doe ook aan de rechterkant. Isoleer de bereiding van de rest van het zenuwstelsel door een definitieve posterior het telencephalon. Gooi het lichaam van het kikkervisje en zorgvuldig flip het weefsel blok op zijn kop, zodat de buikzijde van de hersenen voorbereiding naar boven wijst. Speld het weefsel blok weer door het invoegen van twee naalden tussen de olfactorische zenuwen. Een druppel kikker Ringer oplossing (98 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5 mM glucose, 5 mM Na-pyruvaat, 10 mM HEPES, pH 7,8, osmolaligheid van 230 mOsmol / L) op het weefsel. Verwijder de hersenvliezen die de axon sortering zone en de olfactorische bollen door het maken van drie incisies met behulp van fijne schaar. Vanaf de achterste rand van het weefsel blok, snijd caudorostrally dicht langs de linker olfactorische gloeilamp tot aan de ingang punt van de olfactorische zenuwen in de bollen (de axon sortering zone). Herhaal stap 2.8 voor de rechter hersenhelft. Verhoog de hersenvliezen met een pincet en maak de derde gesneden, loodrecht op de vorige op de axon sortering zone. Let op: De buikzijde van de olfactorische bol is nu toegankelijk voor de beeldvorming en bolus laden. Om de beeldkwaliteit in het doorgezonden beeld licht verbeterd, herhaalt u de procedure voor de rugzijde. Deze extra stappen kunnen de navigatie van de micropipet voor bolus kunnen laden, maar niet strikt noodzakelijk. Breng het monster een opname kamer gevuld met kikker Ringer voor verdere verwerking en weergave. maak sure dat de buikzijde naar boven is gericht en zet het monster met een net van nylon vezels overspannen over een kleine platina frame. Voor een gemakkelijkere toepassing van stimuli plaats de neusholten bovenop één van de nylonvezels. 3. Bolus Loading Los 50 ug van het calcium AM kleurstof (bijvoorbeeld, Fluo-08:00) in 20 pl dimethylsulfoxide (DMSO) met 20% Pluronic F-127 (w / v) om een voorraadoplossing van AM kleurstof bereiden. Bevries de voorraad oplossingen in kleine porties van 1-2 ul volume. De voorraad oplossing is stabiel gedurende tenminste een half jaar maar vermijd vries-dooi cycli. Gebruik een micropipet trekker en trek pipetten met een weerstand van 5-8 MQ en een tip diameter van 1-2 urn. Los het bereide voorraadoplossing van de kleurstof in oplossing kikker Ringer bij een concentratie van 250-500 pM. Voeg MK571 tot een concentratie van 500 uM bereiken multidrug resistance transporters blokkeren. Vul het micropipet met 10 ul van de oplossing met behulp van een langwerpig pipet tip en verwijder alle luchtbellen door flicking de micropipet. Monteer de micropipet in de pipet houder en zorg ervoor dat de druk handmatig kan worden aangebracht met een spuit of een pneumatische drug ejectie apparaat en het toezicht op de uitgeoefende druk met een manometer. Indien mogelijk een microscoop opstelling met de mogelijkheid om de geïnjecteerde kleurstof wekken zodat de uitstroom uit de micropipet tip kan worden gevisualiseerd en aangepast. Gebruik bij voorkeur een confocale beeldvorming setup. Gebruik een rechtopstaande microscoop met een immersie objectief, zodat het weefsel kan worden bereikt met de micropipet. Plaats de hele berg voorbereiding onder de microscoop, volg de olfactorische zenuw tot de lamp en de focus op het gebied van interesse in de olfactorische bulb. Perfuseren verse Ringer oplossing door de opname kamer met het oog op de levensvatbaarheid van het preparaat te verhogen en uit te wassen de kleurstof lekkenvan de micropipet tip. Laat de pipet op het oppervlak van de bulbus olfactorius, met de punt wijst in de rostrale richting van het preparaat. Breng een kleine en een constante positieve druk (~ 25 hPa) naar de micropipet om verstopping van de pipet te voorkomen en steekt hem voorzichtig in het weefsel. Zodra de pipet de buitenste weefsellagen heeft geschonden, verplaatsen in een rostro-dorsale richting in de mitralisklep cellaag. (Merk op dat een tegenkleuring van olfactorische receptor neuronen door elektroporatie is nuttig de positie van de micropipet aanpassen.) Dit plaatst de pipetpunt op een afstand van 50-100 urn van de gewenste opname onderzocht. Voor het kleuren van de temperatuurgevoelige γ-glomerulus doel een gebied van ongeveer 50 pm rostraal van de positie van de presynaptische neuropil van de γ-glomerulus. Breng een positieve druk in het traject van 100-200 hPa. Stel de druksterkte afhankelijk van de grootte vande micropipet tip. Bevestig de uitstroom uit de pipet door te kijken voor lichte weefsel bewegingen zichtbaar onder Brightlight verlichting wanneer druk wordt uitgeoefend voor de eerste keer. Een constante druk gedurende ongeveer 10 minuten onder de micropipet in het weefsel blijft. Als het mogelijk is, controleer dan de neuropil in de tussentijd voor de mobiele laden bij tl-verlichting zo succesvol laden zal leiden tot zichtbare cel Somata kleuring met toenemende intensiteit in de tijd. Let op: Vaak is de reden voor de mislukte lading is pipet verstopping te wijten aan het weefsel invoeren van de tip of geaggregeerde kleurstof clusters. Soms is het mogelijk om de pipet te redden door zachtjes de punt breken tegen het onderoppervlak van de opname kamer. Toch moet de pipetpunt niet meer dan enkele micrometers. Compenseer grotere pipet openingen door het toepassen van een lagere druk tijdens bolus laden. Na de 10 min van lading, vermindering van de toegepaste druk op nul en controleer de kleuring. NotitieDe grootte van de vlek varieert aanzienlijk en hangt af van verschillende parameters, zoals hoeveelheid ingespoten kleurstof en plaats van uitwerpen plaats. Een goede kleuring heeft een oppervlakte van ongeveer 100 urn x 100 urn. Als de vlek is te klein of dekt niet de gewenste opname site, herhaalt u stap 3,10-3,13. Gebruik dezelfde micropipet voor de volgende injectie als het nog niet is verstopt. Wacht ten minste 30 minuten na de laatste injectie voordat u begint met experimenten om kleurstof opname en esterificatie mogelijk te maken. Blijf de opname kamer perfuseren met verse Ringer oplossing te allen tijde. 4. Meting Instellingen Zorg ervoor dat de meetopstelling bestaat uit een confocale microscoop met voldoende snelheid om driedimensionale volumes op te nemen. Kies een overname van ten minste 1 Hz per stack. Let op: Geschikt opstellingen omvatten bijvoorbeeld line-verlichting microscopen scannen van de steekproef line-wise in plaats van punt door point. Een eenvoudige realisatie van een dergelijke opstelling is eerder beschreven 6. Andere opties zijn draaiende schijf microscopen. Indien dergelijke setup is, is het nog steeds mogelijk kleinere gebieden gepaard met een normale point-scanning setup. Stel de meetparameters zodat een volume groot genoeg om de grootte van een glomerulus past kan worden afgedekt. Opmerking: De typische dikte van een opnamevolume in het traject van 20 urn die moet worden door ten minste 5 lagen. Controleer alle presynaptische metingen voor het bleken. Stel het laservermogen tot de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de opgenomen beelden niet in het tijdsverloop van de opname zakt. Beperk de meettijd en oppervlakte van opnamen op de postsynaptische kant bleken zoveel mogelijk te vermijden, hoewel metingen dan 20-30 sec bleken kan optreden. 5. Geur Toepassing en Temperatuur Experimenten giet 25ml verse Ringer oplossing (eerder opgeslagen bij 4 ° C) in een 50 ml buis. Plaats de buis in een ijsemmer. Controleer de temperatuur van de gekoelde Ringer aan door de schone sonde van de thermometer in de buis. Wacht tot de temperatuur daalt tot onder 1 ° C vóór het begin van het experiment. Bereid 50 ml van L-histidine werd opgelost in Ringer oplossing bij een concentratie van 10 uM. Gebruik een trechter applicator 8 of soortgelijke aanvraag systemen waarmee stimulus levering gelijktijdig aan de perfuseren Ringer, zodat de waterstroom in de kamer constant en ononderbroken bij de introductie van de stimulus oplossing blijft. Plaats de trechter zodanig dat het distale uitlaat minder dan 1 mm van de olfactorische epithelium. Plaats een NiCr-Ni temperatuursensor verbonden met een digitale thermometer dichtbij het epitheel en de uitlaat van de trechter applicator. Sluit de thermometer output poort van een computer op te nemen en visueel disspelen voltage veranderingen als gevolg van kleine temperatuurschommelingen. Voordat de proef begon, sluit een andere temperatuursensor een temperatuurmeter de spanning-temperatuur schaalfactor vastgesteld. Onderzoeken de badtemperatuur in de opname kamer en waarborgen dat deze niet groter dan 22 ° C. Start het beeld acquisitie en na elkaar toe te passen 200-400 ul van koude Ringer, L-histidine en kamertemperatuur Ringer (20-22 ° C) via een elektronische pipet met een interstimulus interval van 20-30 sec. Voor een betere controle van de stimulustoediening, laat de stimulus met een triggersignaal van de gekozen imaging opstart naar de pipet indien mogelijk. Herhaal de aanvraag protocol voor reproduceerbare resultaten. Neem sets van meer opnamen met verschillende rondes van stimulatie, omdat ze de voorkeur voor post-imaging analyse van de activiteit correlatie beeldvorming. Opmerking: Een compromis tussen de opnametijd en de slice levensvatbaarheid heeftte vinden. Metingen van ca. 2 min die 6 stimulus toepassingen voldoende activiteit van een reconstructie van het netwerk. 6. Beeldverwerking Met behulp van Activity Correlation Imaging (ACI) Beeldverwerking van de Pre-synaptische Recordings In opnamen met stimulatie door koude Ringer oplossing en histidine onderscheiden temperatuurgevoelige γ-neuropil van de naburige histidine-gevoelige glomerulus door hun verschillende responsprofielen (zie Kludt et al. 5). Een maximale intensiteit uitsteeksel in de axiale richting van opnamen van de hersenen preparaat waarin ORNs werden geëlektroporeerd met twee verschillende kleurstoffen bilaterale innervatie van de γ-glomerulus visualiseren. Beeldverwerking van de Post-synaptische Recordings Met behulp van Activity Correlation Imaging (ACI) Selecteer opnames met voldoende tijd punten (meer dan 100 frames) en een behoorlijke hoeveelheid activiteit (ten minste twee events). Opmerking: Activiteit kan hetzij spontaan aan de processen van één of mitrale cellen geïnduceerd onthullen door verscheidene toepassingen van stimuli in dezelfde opname om het cellulaire netwerk geactiveerd door de olfactorische stimuli onthullen. Kies opnames waarbij de gemeten structuren te bewegen niet meer dan 2-3 pixels in het tijdsverloop van de opname. Opmerking: Opname van te veel beweging kan worden gered door een verschuiving correctieprocedure in Kludt et al 5. Controleer of de opnames last van bleken. Als de gemiddelde intensiteit van het gehele beeld druppels op het tijdsverloop van de opname, bleekmiddel correctie nodig, omdat anders de volgende twee stappen overslaan. Bereken de lineaire trend voor het tijddiagram van elke pixel door het uitvoeren van een lineaire regressie. Trek het resultaat van elke pixel individueel aan de lineaire componen eliminerent van het bleken. Opmerking: Als alternatief Legendre fitting kan worden gebruikt zoals beschreven door Schild Bao en 9. Download de kant-en-klare MATLAB script samen met een stap-voor-stap handleiding voor de activiteit correlatie imaging (ACI), zoals beschreven door Junek et al. 6 Let op: Volg de stappen in Junek et al 6 beschreven als een alternatief voor het gebruik van de meegeleverde MATLAB script.. Verplaats de bestanden 'aci.m', 'matVis.m' en 'aci_roiSelector.m' uit de gedownloade container naar de MATLAB pad van de gebruikt voor data evaluatiesysteem. Laad de ruwe gegevens verkregen in stap 5.8 als variabele user workspace MATLAB georganiseerd als [x, y, z, t] -matrix met x en y verwijzen naar de laterale afmetingen, z de axiale richting en t het tijdsverloop . Call 'ACI' uit de MATLAB opdrachtregel. In de gebruikersinterface (UI)die verschijnt, selecteer 'Prepare Data' en selecteer de variabele met de gegevens en een map waarin de resultaten worden opgeslagen. Opmerking: Voor een volledige beschrijving van de UI zie de handleiding bij de ACI-script. Blader door de gemeten z-lagen door het bewegen van de overeenkomstige schuif in de gebruikersinterface om een ​​overzicht van de kaart variantie weergegeven te krijgen. Voer de grootte van het gebied van belang (ROI) in de UI. Voor een mitrale cel soma stel de ROI tot ongeveer 10 urn in zijdelingse en 5 um in de axiale richting uitstrekken. Een glomerulus, de iets hogere waarden van 20 urn en 10 urn zijdelings axiaal geschikt. Opmerking: De ROI formaat heeft een aantal pixels, die afhankelijk is van de pixel scaling gekozen voor de opname in te voeren. Selecteer een ROI met de γ-glomerulus en aanvullende regio's voor elk zichtbaar soma van de omringende mitralisklep cellen door te klikken met de middelste muisknop op de center van de cel / glomerulus. Sluit het hoofdscherm van de gebruikersinterface die het startsein voor de berekening van de correlatie kaarten voor alle referentie-sporen. Het resultaat wordt automatisch opgeslagen en weergegeven.