Enregistrement Neuronal activité induite de Température-travers le contrôle des modifications de calcium dans le bulbe olfactif de<em> Xenopus laevis</em

Toutes les expériences avec Xenopus laevis têtards ont été réalisées conformément aux lignes directrices approuvées par le Comité d'éthique de l' Université de Göttingen en expérimentation animale. 1. électroporation Choisissez animaux de stades 49-54 selon Nieuwkoop et Faber 7. Assurez-vous que la configuration d'enregistrement est constitué d'un stéréomicroscope avec une grande distance de travail et un dispositif d'électroporation qui peut appliquer des impulsions de tension de 20 V pendant 20 msec à une fréquence d'au moins 2 Hz. Appliquer les impulsions de tension par l'intermédiaire de deux électrodes de platine ayant un diamètre approximatif de 200 pm de sorte qu'ils puissent être insérés dans les narines de têtards sans causer de dommages. Préparer des cristaux d'un colorant conjugué dextrane (par exemple, le calcium vert 10 kDa Dextran, ou Alexa Fluor 647 10 kDa Dextran) en dissolvant la quantité délivrée habituellement de 5 mg à environ 100 pi d'eau distillée et laisser de petites gouttelettes d'2 ul sec sur une feuille de Parafilm. Remarque: Les cristaux secs en moins d'un jour et peuvent être stockées ensuite à -18 ° C au congélateur pendant une période de plus d'un an. Anesthetize les animaux en les plaçant dans l'eau du robinet contenant 3% Tricaine méthane sulfonate pendant 1-2 min jusqu'à ce qu'il atteigne l'état d'anesthésie chirurgicale caractérisée par une diminution de la fréquence cardiaque, la perte de tous les mouvements et le manque de réponses à des stimuli mécaniques. Immerger l'animal anesthésié pendant 10 secondes dans de l'eau du robinet pure. Placez l'animal sur un coussin de gel et de le fixer en plaçant des aiguilles autour de lui sans lui nuire. Note: Ne pas fixer l'animal en poussant des aiguilles à travers sa peau. Séchez délicatement la zone entourant les narines avec un mouchoir en papier. Placez l'animal sous la loupe binoculaire et se concentrer sur les narines. Utilisez une pince pour ramasser un cristal de colorant de taille correspondant à l'orifice narine, placez-le dans une des cavités nasales et attendre jusqu'à ce qu'il se dissout complètement, wUEL prend moins de 1 min. Si les cristaux sont plus petits, ajouter 2 ou 3 dans chaque cavité jusqu'à ce qu'ils produisent une solution de haute concentrée non translucide. Placer la cathode sur la peau du têtard et l'anode dans l'une des narines. Remarque: Ce paramètre particulier applique aux colorants cités dans l'étape 1.3. Pour les colorants ayant une polarité différente, les résultats de la coloration peut être améliorée en plaçant la cathode dans les narines. En cas de doute à propos de la polarité du colorant, les deux électrodes peuvent être placés simultanément dans les narines (un par narine), et la polarité alterne entre des impulsions de tension unique. Appliquer six impulsions de 20 V et 20 msec à environ 0,5 secondes d'intervalle de stimulus. Nota: Les petites bulles doivent apparaître autour de l'électrode dans la narine lors de l'électroporation à condition que les électrodes sont en contact avec la peau et la solution dans la narine. Si aucune bulle sont visibles vérifier les câbles de connexion et assurez-vous que le devic de électroporatione délivre l'impulsion de tension souhaitée. Répétez la procédure (01/09 à 01/11) pour la deuxième narine. Transférez le têtard électroporation dans un bécher rempli d'eau du robinet à la température ambiante. Attendre 5 à 10 min jusqu'à ce que l'animal ne reprenne conscience et reprend sa piscine. Nourrissez-le et laissez-le récupérer pendant au moins 1 jour au cours de laquelle le colorant est transporté le long du nerf olfactif vers le bulbe olfactif. Utilisez les animaux électroporation dans les 1-7 jours suivant la électroporation pour les meilleurs résultats d'imagerie. Donnez au moins 24 fois h pour le transport de colorant et de récupération avant l'imagerie. 2. Monter entier Préparation Anesthetize l'animal dans l'eau du robinet contenant 3% Tricaine méthane sulfonate jusqu'à ce que tous les mouvements ont cessé et il ne répond plus aux stimulations mécaniques. Transférez le têtard à un coussin de gel sous un stéréomicroscope et le fixer solidement en enfonçant des aiguilles à travers la peau de chaque côté de la forebrain. Sacrifiez le têtard en sectionnant sa moelle épinière. Utilisez un scalpel pour disséquer un bloc de tissu contenant les deux cavités nasales, les nerfs olfactifs et bulbes olfactifs (Figure 1A). Faire la première incision près de narine gauche, sans le toucher et déplacer la lame de coupe avant le long du nerf olfactif gauche et le bulbe jusqu'à la frontière télencéphalique-diencéphale. Faites de même sur le côté droit. Isoler la préparation du reste du système nerveux en faisant un postérieur finale de coupe du télencéphale. Éliminer le corps du têtard et retourner soigneusement le bloc de tissu à l'envers de sorte que la face ventrale de la préparation du cerveau tournée vers le haut. Pin à nouveau le bloc de tissu en insérant deux aiguilles entre les nerfs olfactifs. Mettre une goutte de solution Frog Ringer (NaCl 98, 2 mM de KCl, CaCl2 1 mM, MgCl2 2 mM, glucose 5 mM, 5 mM de Na-pyruvate, HEPES 10 mM, ajusté à pH 7,8, Osmolarité de 230 mOsmol / L) sur le tissu. Retirez les méninges couvrant la zone de tri des axones et les bulbes olfactifs en faisant trois incisions à l'aide de ciseaux fins. A partir du bord postérieur du bloc de tissu, couper caudorostrally étroitement le long du bulbe olfactif gauche jusqu'à ce que le point d'entrée des nerfs olfactifs dans les ampoules (la zone de tri des axones). Répétez l'étape 2.8 pour l'hémisphère droit. Soulever les méninges avec des pinces et faire de la troisième coupe, perpendiculaire aux précédents dans la zone de tri des axones. Remarque: La face ventrale du bulbe olfactif est maintenant accessible pour l'imagerie et bolus chargement. Pour améliorer la qualité d'image dans l'image lumineuse transmise, répétez la procédure pour la face dorsale. Ces mesures supplémentaires peuvent faciliter la navigation de la micropipette pour bolus chargement, mais ne sont pas strictement nécessaires. Transférer l'échantillon à une chambre d'enregistrement rempli de Frog Ringer pour un traitement ultérieur et l'imagerie. Fait duure que la face ventrale est orientée vers le haut et de sécuriser l'échantillon avec un filet de fibres de nylon a duré plus d'un petit cadre de platine. Pour une application plus facile des stimuli placer les cavités nasales au-dessus de l'une des fibres de nylon. 3. Bolus Loading Dissoudre 50 pg du calcium AM colorant (par exemple, Fluo-8 heures) dans 20 pi de diméthylsulfoxyde (DMSO) contenant 20% de Pluronic F-127 (p / v) pour préparer une solution de réserve de colorant AM. Congeler les solutions mères en petites aliquotes de 1-2 volumes ul. La solution mère est stable pendant au moins une demi-année, mais éviter les cycles de gel-dégel. Utilisez un extracteur micropipette et tirez pipettes avec une résistance de 5-8 MQ et un diamètre de 1-2 um de pointe. Dissoudre la solution mère préparée du colorant dans la solution de Frog Ringer à une concentration de 250-500 pM. Ajouter MK571 pour atteindre une concentration de 500 uM pour bloquer multirésistantes transporteurs de résistance. Remplir la micropipette avec 10 pi de la solution à l'aide d'une pointe de pipette allongé et enlever toutes les bulles d'air en tapotant la micropipette. Monter la micropipette dans le porte-pipette et assurez-vous que la pression peut être appliqué manuellement à l'aide d'une seringue ou d'un dispositif d'éjection pneumatique médicament et de surveiller la pression appliquée avec une jauge. Si possible, utilisez une configuration de microscope avec la capacité d'exciter le colorant injecté de telle sorte que la sortie de la pointe de micropipette peut être visualisé et ajusté. Idéalement, utilisez une configuration d'imagerie confocale. Utiliser un microscope droit avec un objectif à immersion de telle sorte que le tissu peut être atteint avec la micropipette. Placez l'ensemble de la préparation de montage sous le microscope, suivre le nerf olfactif jusqu'à ce que l'ampoule et de se concentrer sur la zone d'intérêt dans le bulbe olfactif. Perfuser solution fraîche de Ringer à travers la chambre d'enregistrement afin d'accroître la viabilité de la préparation et laver la fuite de colorantde la pointe de micropipette. Abaisser la pipette sur la surface du bulbe olfactif, avec la pointe pointant vers la direction rostrale de la préparation. Appliquer une petite pression positive et constante (environ 25 hPa) à la micropipette pour éviter le colmatage de la pipette et doucement l'insérer dans le tissu. Une fois la pipette a violé les couches de tissu extérieur, la déplacer dans une direction rostro-dorsale dans la couche cellulaire mitrale. (Notez qu'une contre-coloration des neurones récepteurs olfactifs par électroporation est utile pour ajuster la position de la micropipette). Idéalement, placer la pointe de la pipette à une distance de 50 à 100 um à partir du site d'enregistrement souhaité. Pour la coloration de la γ-glomérule sensible à la température, cible une zone d'environ 50 um à partir de la position rostrale du neuropile présynaptique de la γ-glomérule. Appliquer une pression positive dans la plage de 100-200 hPa. Ajuster la force de la pression en fonction de la taille dela pointe de la micropipette. Confirmer la sortie de la pipette en regardant pour de légers mouvements de tissus visibles sous brightlight illumination lorsque la pression est appliquée pour la première fois. Maintenir une pression constante pendant environ 10 minutes tandis que la micropipette reste dans le tissu. Si possible, vérifiez le neuropile dans l'intervalle pour la cellule de chargement sous un éclairage fluorescent chargement réussi entraînera visible coloration soma cellulaire avec une intensité croissante au fil du temps. Remarque: Souvent, la raison pour le chargement qui succombe est pipette colmatage en raison de tissus entrant dans la pointe ou des grappes de colorants agrégés. Il est parfois possible de sauver la pipette en brisant doucement sa pointe contre la surface inférieure de la chambre d'enregistrement. Cependant, la pointe de la pipette ne doit pas dépasser quelques micromètres. Compenser plus grandes ouvertures de pipettes en appliquant une pression plus faible pendant bolus chargement. Après les 10 min de chargement, de réduire la pression appliquée à zéro et vérifier la coloration. RemarqueLa taille de la zone tachée varie considérablement et dépend de plusieurs paramètres tels que la quantité de colorant et l'emplacement du site d'éjection injecté. Une bonne coloration couvre une superficie d'environ 100 um x 100 um. Si la zone tachée est trop petit ou ne couvre pas le site d'enregistrement désiré, répétez les étapes de 3,10 à 3,13. Utiliser les mêmes micro-pipette pour l'injection suivante, si elle n'a pas encore obstruée. Attendre au moins 30 minutes après la dernière injection avant de commencer toute expérimentation pour permettre l'absorption de colorant et désestérification. Continuer à perfuser la chambre d'enregistrement avec une solution de Ringer fraîche en tout temps. 4. Paramètres de mesure Assurez-vous que la configuration de mesure se compose d'un microscope confocal à une vitesse suffisante pour enregistrer trois volumes tridimensionnels. Choisissez un taux d'au moins 1 Hz par pile d'acquisition. Remarque: les configurations appropriées comprennent par exemple des microscopes line-éclairage balayant la ligne par ligne à la place du point par p échantillonoint. Une simple réalisation d'une telle installation a été décrit précédemment 6. D'autres options sont la filature microscopes de disque. Si aucune configuration est disponible, il est encore possible de mesurer des zones plus petites avec une configuration normale de point de balayage. Définissez les paramètres de mesure de sorte qu'un volume assez grand pour accueillir la taille d'un glomérule peut être couvert. Note: L'épaisseur typique d'un volume d'enregistrement est dans la plage de 20 pm qui devrait être couverte par au moins 5 couches. Vérifiez toutes les mesures présynaptiques pour le blanchiment. Régler la puissance du laser jusqu'à ce que l'intensité de fluorescence moyenne des images enregistrées ne diminue pas au cours du temps de l'enregistrement. Limiter le temps de mesure et de la zone pour les enregistrements sur le côté postsynaptique pour éviter le blanchiment autant que possible, bien que pour des mesures supérieures à 20-30 sec blanchiment est susceptible de se produire. 5. Odeur application et expériences de température Verser 25ml de solution de Ringer fraîche (précédemment stockée à 4 ° C) dans un tube de 50 ml. Placer le tube dans un seau à glace. Surveiller la température du Ringer refroidie par l'insertion de la sonde propre d'un thermomètre dans le tube. Attendez jusqu'à ce que la température descend en dessous de 1 ° C avant de commencer l'expérience. Préparer 50 ml de L-histidine dissous dans une solution de Ringer à une concentration de 10 uM. Utilisez un applicateur d'entonnoir 8 ou systèmes d'application similaires permettant la livraison de stimulation concomitante à la sonnerie perfuser de sorte que le débit d'eau dans la chambre reste constante et ininterrompue pendant la libération de la solution de relance. Positionnez l'entonnoir de telle sorte que la sortie distale est inférieure à 1 mm de l'épithélium olfactif. Placer un capteur de température NiCr-Ni relié à un thermomètre numérique à proximité de l'épithélium et la sortie de l'applicateur en forme d'entonnoir. Câbler le port de sortie du thermomètre à un ordinateur pour enregistrer et visuellement disjouer des variations de tension reflétant les petites variations de température. Avant de commencer l'expérience, connecter un autre thermosenseur à un thermomètre étalon pour établir le facteur d'échelle de tension-température. Enquête sur la température du bain dans la chambre d'enregistrement et de veiller à ce qu'elle ne dépasse pas 22 ° C. Démarrez l'acquisition d'images et d'appliquer séquentiellement 200-400 pi de Ringer à froid, L-histidine et Ringer température ambiante (20-22 ° C) par l'intermédiaire d'une pipette électronique avec un intervalle interstimulus de 20-30 sec. Pour un meilleur contrôle de l'application du stimulus, avec le stimulus libérer un signal de déclenchement envoyé par l'installation de formation d'image choisie à la pipette, si possible. Répéter le protocole d'application pour obtenir des résultats reproductibles. Prenez des ensembles de plus longs enregistrements avec plusieurs séries de stimulation car ils sont préférables pour l'analyse post-imagerie avec l'imagerie activité de corrélation. Note: Un compromis entre la durée d'enregistrement et la viabilité de la tranche aêtre trouvé. Mesures d'environ 2 min couvrant 6 applications de relance fournissent une activité suffisante pour une bonne reconstruction du réseau. 6. Traitement d'images en utilisant l'activité Corrélation Imaging (ACI) Traitement de l'image des enregistrements pré-synaptiques Dans des enregistrements avec une stimulation par une solution de Ringer froide et de l' histidine, de distinguer le γ-neuropile sensible à la température du glomérule histidine sensibles voisins par leurs profils de réponse différents (voir Kludt et al. 5). Créer une projection d'intensité maximale dans la direction axiale à partir des enregistrements de la préparation du cerveau dans lequel Orns ont été électroporées avec deux colorants différents pour visualiser l'innervation bilatérale du γ-glomérule. Traitement de l'image des enregistrements post-synaptiques Utilisation Activité Corrélation Imaging (ACI) Sélectionnez des enregistrements avec des points de temps suffisant (plus de 100 cadres) et une bonne quantité d'activité (au moins deux événements). Note: L'activité peut être soit spontanée de révéler les processus de cellules mitrales simples ou induite par plusieurs applications de stimuli au cours de la même enregistrement pour révéler les réseaux cellulaires activés par les stimuli olfactifs. Choisir les enregistrements où les structures de mesure se déplacent pas plus de 2 à 3 pixels au cours du temps de l'enregistrement. Remarque: Les enregistrements avec trop de mouvement peuvent être sauvés par l' application d' une procédure de correction de décalage décrit dans Kludt et al 5. Vérifiez si les enregistrements souffrent de blanchiment. Si l'intensité moyenne de l'ensemble de l'image diminue au cours du temps de l'enregistrement, la correction de l'eau de Javel est nécessaire, sinon sauter les deux étapes suivantes. Calculer la tendance linéaire de la trace temporelle de chaque pixel en effectuant une régression linéaire. Soustraire le résultat de chaque pixel individuellement pour éliminer le componen linéairet du blanchiment. Remarque: En tant que raccord Legendre alternatif peut être utilisé comme décrit par Bao et Schild 9. Télécharger le script prêt à utiliser MATLAB conjointement avec un guide étape par étape pour l' imagerie activité de corrélation (ACI) comme décrit par Junek et al. 6 Remarque: Suivez les étapes décrites dans Junek et al 6 comme une alternative à l' aide du script MATLAB fourni.. Déplacer de la aci.m 'les fichiers,' matVis.m 'et' aci_roiSelector.m 'du conteneur téléchargé sur le chemin MATLAB du système utilisé pour l'évaluation des données. Charger les données brutes acquises à l' étape 5.8 en tant que variable à l' utilisateur l'espace de travail Matlab organisée comme une -MATRIX [x, y, z, t] avec x et y se référant aux dimensions latérales, z, la direction axiale et t, au cours du temps . Call 'aci' à partir de la ligne de commande MATLAB. Dans l'interface utilisateur (UI),qui apparaît, sélectionnez «Préparer les données», puis sélectionnez la variable contenant les données et un répertoire dans lequel les résultats seront sauvegardés. Remarque: Pour une description complète de l'interface utilisateur voir le manuel accompagnant le script aci. Faites défiler les z-couches mesurées en déplaçant le curseur correspondant dans l'interface utilisateur pour obtenir une vue d'ensemble de la carte de la variance affichée. Entrez la taille de la région d'intérêt (ROI) dans l'interface utilisateur. Pour un corps cellulaire mitrale ajuster la ROI pour couvrir environ 10 um dans le sens latéral et 5 micromètres dans la direction axiale. Pour un glomérule, les valeurs légèrement plus élevées de 20 um latéralement et 10 um axialement sont appropriées. Note: La taille de retour sur investissement doit être entré comme un certain nombre de pixels, qui dépend de la mise à l'échelle du pixel choisi pour l'enregistrement. Sélectionnez un ROI contenant le γ-glomérule et des régions supplémentaires pour chaque soma visible des cellules mitrales environnantes en cliquant avec le bouton central de la souris sur le center de la cellule / glomérule. Fermez l'interface principale qui déclenche le calcul de la corrélation des cartes pour toutes les traces de référence. Le résultat est automatiquement enregistré et affiché.